experimentele verificatie van modellen
De eerste benadering (3) identificeerde de primaire initiatieplaatsen in 14 eiwitten, waaronder RNase A in de pancreas van runderen en myoglobine van potvissen, en ook andere minder stabiele initiatieplaatsen (11) in RNase A. de primaire initiatieplaats voor RNase A werd in dit model geïdentificeerd als residuen 106-118. Toepassing van de tweede benadering (8) op RNase A (13) leidde tot zes plaatsen (zie Fig., 3 a), die in overeenstemming waren met die welke in de eerste benadering (11) werden vastgesteld (3). Dit zijn residuen 4-11 (regio a), residuen 25-34 (Regio B), residuen 51-57 (regio C) en antiparallelstructuren (niet noodzakelijk geplooide vellen) die worden gevormd door de associatie van residuen 53-67 met residuen 69-79 (regio D), residuen 71-90 met residuen 91-111 (regio E) en residuen 103-111 met residuen 115-124 (regio F). De volgende stappen langs de vouwroute bestaan uit de groei of coalescentie van deze regio ‘ s. Gebied G wordt gevormd wanneer residuen 36-48 vouwen tegen helix B., Regio G bevat echter contacten met een groter bereik dan helix B. Daarom wordt G geacht in een later stadium te vormen Dan B. Regio L wordt gevormd door associatie van regio A met B, G en C. Deze structurele volgorde wordt gevolgd door regio H, gevormd wanneer regio C en D in contact komen; door regio K met contacten tussen regio ’s E en F; Door regio J waarin regio’ s C en D contacten vormen met regio ’s E en F; en door regio I met contacten van regio’ s E en H met G. tenslotte wordt regio M gevormd wanneer Regio A in contact komt met E en F.,
de voorspelde primaire vouw-initiatieplaats van RNase A is in overeenstemming met de waargenomen wending van de residuen 113 en 114 in het inheemse molecuul, met de zeer hoge mate van conservering van niet-polaire residuen in locatie 106-118 van 23 zoogdiersoorten van dit eiwit (3), en met experimentele informatie over tussenproducten die zijn gevonden in de thermische ontvouwing van RNase A (14)., NMR bewijs voor lokale structuur in uitgevouwen RNase A onder vouwomstandigheden (15) en in fragmenten daarvan (16), en immunochemische studies over de vorming van stabiele antigene plaatsen (op het oppervlak van het eiwit, die de begraven primaire hydrofobe initiatieplaats wanneer gereduceerde RNase A wordt geoxideerd (ref. 17 en figuur 8 van ref. 18), waren ook in overeenstemming met dit beeld. Andere experimentele gegevens die het bestaan van initiatieplaatsen A-F ondersteunen, zijn te vinden in ref. 11.,
voor apomyoglobine identificeerde de eerste benadering (3) de primaire vouw-initiatieplaats als residuen 103-115, die het grootste deel van de G-helix omvat, met de sequentie Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-Ser-Glu-Ala-Ile-Ile-His-Val-Leu., Toepassing van de tweede benadering (8) en conformatie-energieberekeningen leidden tot de suggestie dat interacties tussen de A -, G-en H-helices van apomyoglobine van belang kunnen zijn voor het initiëren van de vouw (19), in overeenstemming met experimentele resultaten die deze regio ‘ s impliceerden in evenwichtsintermediaten van apomyoglobine (20) en in de vroegste kinetische stappen in de vouwroute (21). Recente experimentele studies van mutanten van myoglobine (22, 23) bieden overtuigende ondersteuning voor modellen die hydrofobe initiatie en voortplanting van het vouwen op te nemen.,
Apomyoglobine is een paradigma geworden voor onderzoek naar folding pathways (24). Een deel van het apomyoglobin-molecuul, bestaande uit de A -, G-en H-helices en een deel van de B-helix, vouwt snel om een tussenproduct te vormen, waarbij de rest van de polypeptideketen langzamer vouwt, in de Orde van seconden (21,25). Peptide fragmenten van apomyoglobine die overeenkomen met de G en H helices vertoonden een neiging tot spiraalvormige structuur (26-28), terwijl peptiden die overeenkomen met de rest van het eiwit veel lagere neiging tot spiraalvorming vertoonden (29)., Toch toonde een experiment waarbij de H-helix van myoglobine werd gemuteerd om zijn spiraalvormige neiging te verminderen (30) zeer weinig invloed op de vouwsnelheid van het eiwit. Een veel groter effect werd waargenomen wanneer het distale histidine (H64) werd veranderd in fenylalanine: de vervanging van een niet-polaire zijketen voor het begraven polaire histidine resulteerde in een significante toename van de vouwsnelheid (31). Deze studies wezen op het belang van zijketenverpakking, in het bijzonder in de contactoppervlakken van schroefjes, voor de vouwsnelheid van apomyoglobine.,
Apomyoglobine heeft het voordeel dat het bij evenwicht kan worden bestudeerd onder een aantal oplossingsomstandigheden die een aantal van de waarneembare stadia op de kinetische vouwroute benaderen. Aldus, is het mogelijk geweest om de conformational neigingen van uitgevouwen en gedeeltelijk gevouwen apomyoglobine door NMR (32-35) te definiëren. Interessant is dat zuur-ontvouwde apomyoglobine een neiging vertoont voor niet-inheemse spiraalvormige structuur in een gebied dat de D-en E-spiraaltjes verbindt, evenals de inheemse-achtige structuur waargenomen in de A-en H-spiraaltjes, die voorspeld was in de kinetische studies (34)., De NMR studies van de conformationele neigingen van de verschillende vormen van apomyoglobine (32-35) omvatten bepaling van de relaxatieparameters van de polypeptideketen om specifiek de wervelbeendynamiek in elk van de Staten van het eiwit te bepalen. In plaats van de” model-vrije ” analyse die geschikt is voor gevouwen proteã nen, werden de ontspanningsgegevens geanalyseerd door verminderde spectrale dichtheidsfuncties J(0), J(wN), en J(wH) (36) te berekenen. De functie J (0) informeert over µs-ms tijdschaal bewegingen en gesuggereerd dat, Voor apomyoglobine bij pH 2.,3, de A-en G-helices maakten tijdelijke contacten (34). Dit opwindende resultaat, later gevalideerd door spin-label NMR studies (37), leverde definitief bewijs van native-like lange-afstand contacten in een ontvouwde proteã ne. Nog intrigerender, de functie J(wN), die informeert over ps–ns tijdschaal beweging, toonde sequentieafhankelijke variatie, die kan worden gecorreleerd met variatie in een berekende parameter, De “gemiddelde oppervlakte begraven bij vouwen” (AABUF) (10)., Deze parameter, die zowel residugrootte als hydrophobicity omvat, wordt gedefinieerd voor individuele aminozuren, maar wordt gewoonlijk gemiddeld over een venster van vijf tot negen residuen in de opeenvolging en verstrekt een alternatieve kwantitatieve raming van de hydrophobicity door Matheson en Scheraga (3) in termen van vrije energie van vorming wordt gedefinieerd. In het geval van apomyoglobine bij pH 2,3, pieken in de grafiek van J(wN) vs., het residugetal, dat wijst op een beperking van de sub-ns tijdschaal beweging, kwam zeer goed overeen met pieken in de aabuf plot, die wijzen op een hoger dan gemiddeld aantal grote en/of niet-polaire aminozuren. Deze observatie suggereerde dat er een patroon in de aminozuurvolgorde is, gedefinieerd door groepen van grote en / of niet-polaire zijketens, zoals in het model van ref. 3, die tot beperking van de motie van de polypeptidebackbone leidt die door lokale hydrophobic clustervorming wordt veroorzaakt.
Apomyoglobine bij pH 2.,3 behoudt een geringe neiging tot schroefstructuur in de A-en H-schroefverbindingen, zoals beoordeeld door de waargenomen NMR-chemische verschuivingen (34). Deze neigingen worden afgeschaft in aanwezigheid van 8 M ureum (35), maar de sequentieafhankelijkheid van de relaxatiesnelheden van ureum-gedenatureerde apomyoglobine vertoont ook een intrigerende correlatie met de aabuf-parameter. In dit geval is de correlatie tussen minima in J(wH) en maxima van AABUF, wat suggereert dat lokale hydrofobe interacties die backbone beweging beperken op sub-ns tijdschalen persistent zijn, zelfs in 8 m ureum.,
om de hypothese te testen dat de aabuparameter, d.w.z. hydrofobiciteit, kan worden gebruikt om de vouw-initiatieplaatsen in de polypeptideketen te voorspellen, werd een specifieke set apomyoglobinemutaties gemaakt (23). De a-helix, die deelneemt aan het kinetische tussenproduct dat Voor het eerst wordt gevormd bij het vouwen van WT apomyoglobine, heeft een sequentie die leidt tot een maximum in de aabuf parameter, terwijl de e-helix, die in feite zeer hydrophobic is volgens conventionele hydrophobicity schalen, een vrij lage AABUF over zijn lengte heeft., In gevouwen apomyoglobine, ligt de zijketen van Trp-14, in de a helix, tegenover de ruggengraat van de e helix bij Gly-73. Een dubbel-mutant myoglobine werd bereid, waarin Trp-14 werd vervangen door Gly, en Gly-73 werd vervangen door Trp. Er werd aangevoerd dat de gevouwen structuur van het eiwit minimaal verstoord zou moeten worden door deze swap, maar dat de aabuparameter voor de A-en E-helices drastisch zou moeten worden beïnvloed. De vraag was of het vouwpad ook zou worden beïnvloed. Inderdaad, het vouwen van de mutant waarin G73 en W14 worden verwisseld gebeurt via een andere route dan het WT-eiwit., Alle apomyoglobine varianten die tot nu toe zijn bestudeerd vouwen via een burst fase intermediair die spiraalvormige structuur bevat. In het geval van WT apomyoglobine bevat dit tussenproduct de A -, G-en H-helices (en ook een deel van de B-helix). In de G73-W14 swap mutant bevat het tussenproduct de E, G en H helices; de A helix wordt niet beschermd in de beginfase van het vouwen, maar vouwt later. Dit resultaat (geïllustreerd in Fig. 4) werd bevestigd door spin-label studies waaruit contacten tussen de E, G en H helices in de mutant, in plaats van de A, G en H contacten waargenomen in het WT eiwit.,