Eksperimentell Verifisering av Modeller
første tilnærming (3) identifisert den primære initiation nettsteder i 14 proteiner, inkludert storfe i bukspyttkjertelen RNase A og spermhval myoglobin, og også andre mindre stabil initiation nettsteder (11) i RNase A. Den primære initiation stedet for RNase A ble identifisert i denne modellen som rester 106-118. Anvendelse av den andre tilnærmingen (8) til RNase A (13) førte til at seks områder (illustrert i Fig., 3 a), som var konsistente med de som er identifisert (11) ved første tilnærming (3). Dette er rester 4-11 (område A), rester 25-34 (område B), rester 51-57 (område C), og antiparallel strukturer (ikke nødvendigvis plisserte ark) dannet ved sammenslutning av rester 53-67 med rester 69-79 (område D), rester 71-90 med rester 91-111 (region E), og rester 103-111 med rester 115-124 (region F). Den etterfølgende trinn langs den røde sti består av vekst eller sammensmeltningen av disse regionene. Regionen G dannes når rester 36-48 kaste mot helix B., Område G, imidlertid, inneholder langsiktige kontakter enn ikke helix B. Derfor, G er vurdert til å danne et senere tidspunkt enn B. Regionen L er dannet ved sammenslutning av område A med B, G og C. Dette strukturelle sekvens følges av regionen H, dannet når regioner C og D kommer i berøring; av region K som inneholder kontakter mellom regioner E og F; fra region til region J i hvilke regioner C-og D-form kontakter med regioner E og F; og etter region, jeg som inneholder kontakter på regioner E og H med G. Endelig, region M dannes når regionen En kommer i kontakt med E og F.,
De foreslåtte primære folding initiation siden av RNase A er i overensstemmelse med den observerte slå på rester 113 og 114 i det opprinnelige molekylet, med svært høy grad av bevaring av upolare rester i området 106-118 av 23 pattedyr arter av dette proteinet (3), og med eksperimentell informasjon på viderekommende oppdaget i termisk utfoldelsen av RNase A (14)., NMR bevis for lokale strukturen i utfoldet RNase A under folding forhold (15) og fragmenter av disse (16), og immunochemical studier på dannelse av stabile antigene nettsteder (på overflaten av protein, som dekker gravlagt primære hydrofobe initiation siden da redusert RNase A er oksidert (ref. 17 og figur 8 i ref. 18), var også i overensstemmelse med dette bildet. Andre eksperimentelle bevis som støtter eksistensen av initiering områdene A-F er gitt i ref. 11.,
For apomyoglobin, den første tilnærming (3) identifisert den primære folding initiation nettstedet som rester 103-115, som omfatter store deler av den G helix, med sekvensen Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-D-Glu-Ala-Ile-Ile-Hans-Val-Leu., Anvendelse av den andre tilnærmingen (8), og conformational-energi-beregninger, førte til forslag om at interaksjon mellom A, G, og H helices av apomyoglobin kan være viktig for folding initiation (19), i samsvar med eksperimentelle resultater som er innblandet disse regionene i likevekt mellomprodukter av apomyoglobin (20) og i de tidligste kinetisk trinnene i den røde sti (21). Nyere eksperimentelle studier av mutanter av myoglobin (22, 23) gir overbevisende støtte for modeller som inkorporerer hydrofobe initiering og overføring av folding.,
Apomyoglobin har blitt et paradigme for forskning på folding trasé (24). En del av apomyoglobin molekyl, bestående av A, G, og H helices og en del av B-helix, folder raskt å danne en sti middels, med resten av polypeptid kjede folding ved en lavere pris, på ordre av sekunder (21, 25). Peptid fragmenter av apomyoglobin tilsvarende G og H helices viste en tilbøyelighet for spiralformet struktur (26-28), mens peptider tilsvarende resten av protein viste langt lavere tilbøyelighet for helix-formasjonen (29)., Ennå et eksperiment der H helix av myoglobin var mutert til å redusere sin spiralformet tilbøyelighet (30) viste svært liten innflytelse på folding frekvensen av protein. En mye større effekt ble observert når den distale histidin (H64) ble endret til fenylalanin: substitusjon av en upolar side kjede for gravlagt polar histidin resulterte i en betydelig økning i frekvensen av folding (31). Disse studiene peker mot viktigheten av side-chain-pakking, spesielt i kontakt med flatene i helices, for prisen av folding av apomyoglobin.,
Apomyoglobin har den fordelen at det kan bli studert ved likevekt under en rekke løsning forhold som omtrentlige noen av de observerbare etapper på kinetisk folding veien. Derfor har det vært mulig å definere conformational propensities av tydelighet og delvis kastet apomyoglobin av NMR (32-35). Interessant, syre-utfoldet apomyoglobin viser en tilbøyelighet for ikke-innfødte spiralformet struktur i en region som forbinder D og E helices, samt native-lignende struktur observert i En og H helices, som hadde blitt spådd i den kinetiske studier (34)., NMR studier av conformational propensities av ulike former for apomyoglobin (32-35) inkludert fastsettelse av avslapning parametere av polypeptid kjede til nettstedet ditt-spesielt bestemme ryggraden dynamikk i hver av statene av protein. I stedet for «modell-free» – analyse som er egnet for foldet proteiner, avslapping data ble analysert ved beregning av redusert spectral density funksjoner J(0), J(wN), og J(wH) (36). Funksjonen J(0) informerer på µs–ms tid-skala bevegelser og foreslo at, for apomyoglobin ved pH 2.,3, A og G helices var å lage forbigående kontakter (34). Denne spennende resultat, senere validert av spin-label NMR studier (37), forutsatt definitive bevis for native-som lang rekke kontakter i en utbrettet protein. Enda mer intriguingly, funksjon J(wN), som informerer på ps–ns-en tid-skala bevegelse, viste rekkefølge avhengig av variasjon, som kan være korrelert med variasjonen i en beregnet parameter, den «gjennomsnittlige området gravlagt ved folding» (AABUF) (10)., Denne parameteren, som inkorporerer både rester størrelse og hydrophobicity, er definert for det enkelte aminosyrer, men er vanligvis fordelt på et vindu av fem til ni rester i rekkefølge, og gir et alternativ kvantitative estimat av hydrophobicity definert av Matheson og Scheraga (3) i form av fri energi for dannelse. I tilfelle av apomyoglobin ved pH 2.3, topper i handlingen i J(wN) vs., rester tall, som angir begrensning av sub-ns-en tid-skala bevegelse, tilsvarte svært godt med topper i AABUF tomten, som indikerer en høyere enn gjennomsnittlig antall av store og/eller upolare aminosyrer. Denne observasjonen antydet at det er et mønster i aminosyresekvens, definert ved grupperinger av store og/eller upolare sidekjeder, som i modellen av art. 3, som fører til begrensning av bevegelse av polypeptid ryggraden forårsaket av lokale hydrofobe klynge dannelse.
Apomyoglobin ved pH 2.,3 beholder en liten tilbøyelighet for spiralformet struktur i En og H helices, som bedømmes av den observerte NMR kjemiske skift (34). Disse propensities er avskaffet i nærvær av 8 M urea (35), men sekvensiell avhengighet av avslapning priser for urea-denaturert apomyoglobin viser også en interessant sammenheng med AABUF parameter. I dette tilfellet er korrelasjonen er mellom minima i J(wH) og maxima av AABUF, noe som tyder på at lokale hydrofobe interaksjoner som begrenser ryggraden bevegelse på sub-ns tidsskalaer er vedvarende selv i 8 M urea.,
for Å teste hypotesen om at AABUF parameter, dvs., hydrophobicity, kunne brukes til å forutsi folding initiation nettsteder i polypeptid kjede, et bestemt sett av apomyoglobin mutasjoner ble gjort (23). I En spiral, som deltar i den kinetiske mellomliggende som er først dannet ved folding av WT apomyoglobin, har en rekkefølge som gir opphav til et maksimum i AABUF parameter, mens E helix, som er faktisk svært hydrofobe i henhold til konvensjonell hydrophobicity skalaer, har en ganske lav AABUF i hele sin lengde., I foldet apomyoglobin, siden kjeden av Trp-14, i En spiral, som ligger på motsatt side av ryggraden i E helix på Gly-73. En dobbel-mutant myoglobin var forberedt, der Trp-14 ble erstattet med Gly, og Gly-73 ble erstattet med Trp. Det ble begrunnet med at brettet struktur av proteiner bør være minimum opprørt av dette swap, men at AABUF parameter for A-og E-helices bør være drastisk berørt. Spørsmålet var om den regulerbare veien vil også bli berørt. Faktisk, folding av mutant som G73 og W14 er byttet skjer ved en annen vei enn den WT protein., Alle apomyoglobin varianter som så langt har blitt studert brett via en burst fase mellomliggende som inneholder spiralformet struktur. I tilfelle av WT apomyoglobin, dette mellomliggende inneholder A, G, og H helices (og også en del av B-helix). I G73–W14 swap mutant, det mellomliggende inneholder E, G, og H helices; den En helix er ikke beskyttet i den innledende fasen av folding, men folder senere. Dette resultatet (illustrert i Fig. 4) ble bekreftet av spin-label studier som viser kontakter mellom E, G, og H helices i mutant, snarere enn En, G, og H kontakter observert i WT protein.,