Dette materialet er ledsaget av en presentasjon på protein struktur og prinsippene bak denaturing prøver og usammenhengende gel elektroforese.
separasjon av makromolekyler i et elektrisk felt kalles elektroforese. En veldig vanlig metode for separasjon av proteiner ved elektroforese bruker en usammenhengende polyakrylamid gel som en støtte medium og sodium dodecyl sulfat (SDS) til denaturering av proteiner. Metoden kalles sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE)., De mest brukte systemet er også kalt Laemmli metode etter U.K. Laemmli, som var den første til å publisere en papir ansette SDS-SIDE i en vitenskapelig studie.
SDS (også kalt laurylsulfat) er en anioniske vaskemiddel, noe som betyr at når oppløst sin molekylene har en netto negativ ladning innenfor et bredt pH-område. Et polypeptid kjede som binder mengder av SDS i forhold til sin relative molecuar masse. Den negative ladninger på SDS ødelegge det meste av kompleks struktur av proteiner, og er sterkt tiltrukket mot en anode (positivt ladet elektrode) i et elektrisk felt.,
Polyakrylamid geler begrense større molekyler fra migrere så fort som mindre molekyler. Fordi den gratis-til-masse forholdet er nesten den samme blant SDS-denaturert polypeptides, endelig separasjon av proteiner er avhengige nesten utelukkende på forskjeller i relativ molekylære massen av polypeptides. I en gel av uniform tetthet relativ migrasjon avstand av et protein (Rf-f som en senket skrift) er negativt proporsjonal med logaritmen av sin masse., Hvis proteiner av kjent masse kjøres samtidig med ukjente, forholdet mellom Rf og masse kan plottes, og massene av ukjente proteiner beregnet.
Protein separasjon ved SDS-PAGE kan brukes til å estimere relativ molekylære massen, for å bestemme den relative overflod av store proteiner i en prøve, og til å bestemme fordelingen av proteiner blant fraksjoner. Renheten av protein prøver kan bli vurdert og fremdriften av en fractionation eller rensing prosedyre kan følges., Ulike flekker metoder kan brukes til å oppdage sjeldne, proteiner og for å lære noe om deres biokjemiske egenskaper. Spesialiserte teknikker som Western blotting, to-dimensjonal elektroforese, og peptid kartlegging kan brukes til å oppdage ekstremt knappe genet produkter, for å finne likheter mellom dem, og til å gjenkjenne og skille isoenzymes av proteiner.
Molekylær masse versus molekylvekt
Molekylære massen (symbol m) er uttrykt i dalton-brødrene (Da). En Dalton er definert som 1/12 av massen av karbon-12., De fleste makromolekyler er store nok til å bruke kiloDalton (kDa) for å beskrive molekylære massen. Molecular vekt er ikke det samme som molekylære massen. Det er også kjent som relativ molekylære massen (symbol Mr, hvor r er en senket skrift). Molekylvekt er definert som forholdet mellom massen av en macromolecule til 1/12 av massen til et karbon-12 atom. Det er en dimensionless kvantitet.
Når litteraturen gir en masse i Da eller kDa det refererer til molekylær masse. Det er feil å uttrykke molecular vekt (relativ molekylære massen) i dalton-brødrene., Likevel vil du finne begrepet molekylvekt brukes med dalton-brødrene eller kiloDaltons i noen litteratur, ofte med forkortelsen MW for molekylær vekt.
Polyakrylamid geler for SDS-PAGE
Mange systemer for protein elektroforese har blitt utviklet, og apparatet brukes for SDS-PAGE varierer mye. Metodene som er brukt på disse sidene benytter Laemmli metode. Referanse til Laemmli metode i et materiale og metoder del eliminerer behovet for å beskrive buffere, støping av gels, apparater, etc., Mindre papir bruker noen endring av metode, bare detaljer av SDS-SIDE som skal rapporteres i en metoder delen er prosent av totalt akrylamid (%T) i en gel, relative andel og type crosslinker (%C), og kanskje en referanse til gel dimensjoner. Vi bruker en «mini-gel» system, med 3 1/4″ x 4″ gel-kassetter.
SDS-SIDE kan bli gjennomført på pre-cast gels, lagre trøbbel og fare for å jobbe med akrylamid. Følgende beskrivelse gjelder for butikk-laget støping og kjører apparatet som er mye billigere enn kommersielt tilgjengelig utstyr., I tillegg til kostnadseffektivitet, en fordel med å gjøre en egen gels første gang er en dypere forståelse av prosessen.
Uavhengig av system, forberedelse krever støping to forskjellige lag av akrylamid mellom glassplatene. Det nedre laget (skille, eller løse, gel) er ansvarlig for å faktisk skille polypeptides etter størrelse. Det øvre laget (stabling gel) omfatter eksempel brønner. Den er designet for å feie opp proteiner i et eksempel mellom to bevegelige grenser slik at de er komprimert (stablet) i mikrometer tynne lag når de nå å skille gel.,