Gel Elektroforese Definisjon
Gel elektroforese er en prosedyre som brukes for å skille biologiske molekyler etter størrelse. Separasjon av disse molekylene er oppnådd ved å plassere dem i en gel med små porene og skaper et elektrisk felt over gelen. Molekylene beveger seg raskere eller langsommere basert på deres størrelse og elektrisk ladning.,
Gel Elektroforese Oversikt
prosessen med gel elektroforese fungerer fordi negativt ladede molekyler bevege seg bort fra den negative polen på elektrisk strøm og mindre molekyler vil bevege seg raskere enn større molekyler. Dermed, en størrelse separasjon er oppnådd innenfor pool av molekyler som kjører gjennom gelen. Gelen virker på en lignende måte til en sil skille ut partikler med størrelse. Den elektroforese arbeider for å flytte partikler, ved hjelp av sine iboende elektrisk ladning, gjennom sil.,
Når forskerne forsøker å skille mellom ulike segmenter av DNA, for eksempel er prosessen enkel. Prøvene er lagt til kanaler i starten av gel. Hver DNA-molekylet har samme kostnad (-1), fordi DNA er dannet av de samme 4 nukleotider og har alltid en litt negativ kostnad uavhengig av dens størrelse. Derfor er hvert DNA-molekyl vil ha den samme kraften trekke den gjennom gelen.
Imidlertid er størrelsen av hvert molekyl hindrer fremgang gjennom gelen., Store molekyler som rammet deler av gel-matrise, og er bremset ned. Små DNA-molekyler kan glippe mellom de ulike komponentene av gel-matrise, og raskt gjøre veien til den andre siden av gel. Etter en viss tid, farget DNA-molekyler som kan sees samle inn i ulike områder av gel, basert på hvor langt de har flyttet i løpet av gel elektroforese. Dette gjør at forskere å identifisere segmenter, og sammenligne DNA fra ulike organismer.
Hva er Gel Electrophoreses Brukt Til?,
formålet med gel elektroforese er å visualisere, identifisere og skille molekyler som har blitt behandlet av en tidligere metoden som PCR, enzymatisk fordøyelse eller en eksperimentell tilstand. Ofte blandinger av nukleinsyrer eller proteiner som er samlet inn fra et tidligere eksperiment/metode er å kjøre gjennom gel elektroforese for å fastslå identiteten eller skille mellom molekyler.,
Gel Elektroforese Trinn
Den brede trinnene som er involvert i en felles DNA-gel elektroforese protokoll:
Klargjøring av prøver for å kjøre
DNA isolert og preprocessed (f.eks. PCR, enzymatisk fordøyelse) og gjorde opp i løsning med noen grunnleggende blått fargestoff å bidra til å visualisere bevegelse av prøven gjennom gelen.
En agarose TAE gelen er forberedt
TAE-buffer gir en kilde til ioner for å sette opp det elektriske feltet i løpet av elektroforese., Vekt-til-volum konsentrasjon av agarose i TAE-buffer brukes til å forberede løsning. For eksempel, hvis en 1% agarose gel er nødvendig, 1g av agarose er lagt til 100 ml TAE. Den agarose prosentandel som brukes er bestemt av hvor stor eller liten DNA er forventet å være. Hvis man er ute på som skiller en pool av mindre størrelse DNA-bånd (<500bp), en høyere prosentandel agarosegel (>1%) er forberedt. Jo høyere prosentandel av agarose skaper en tettere sil for å øke utskillelsen av små DNA-lengde forskjeller., Den agarose-TAE løsning er oppvarmet til å oppløse agarose.
gelen
agarose TAE løsningen helles i en avstøpning skuff som, når gelen er avkjølt og stivnet, skaper en gel skive med en rad av brønner på toppen.
Sette opp elektroforese kammer
solid gel er plassert i et kammer fylt med TAE-buffer. Gelen er plassert slik at kammeret brønner er nærmest til den negative elektroden i kammeret.,
Mates gel
gel kammer brønner er lastet med DNA-prøver, og vanligvis en DNA-stige er også lagt inn som referanse for størrelser.
Elektroforese
De negative og positive fører er koblet til koven og til en strømforsyning hvor spenningen ligger. Slå på strømforsyningen setter opp det elektriske feltet og negativt ladet DNA-prøver vil begynne å migrere gjennom de gel og bort fra den negative elektroden mot det positive.,
Stoppe elektroforese og visualisere DNA
Når blått fargestoff i DNA-prøver har migrert gjennom gelen langt nok, strømforsyningen er slått av og at produktet er fjernet og plassert inn i en etidiumbromid løsning. Etidiumbromid intercalates mellom DNA og er synlig i UV-lys. Noen ganger etidiumbromid er lagt direkte til agarosegel løsning i trinn 2. Den etidiumbromid farget gel er så eksponert for UV-lys, og bildet er tatt. DNA-båndene er visualisert i fra hver lane tilsvarende et kammer godt., DNA-stige som ble lagt inn er også visualisert og lengden av DNA-båndene kan bli estimert. Et eksempel er gitt i figuren nedenfor.
Typer Gel Elektroforese
Det er to typer gel elektroforese: innfødte og denaturing. Native gel elektroforese vanligvis forsøk på å holde RNA eller protein i sin opprinnelige struktur mens du kjører det gjennom gelen., Denaturing gel elektroforese forsøk på å redusere RNA eller protein i sin mest lineær struktur før eller i løpet av gel elektroforese.
denaturering av RNA eller protein er oppnådd ved å legge til en reduksjon agent for eksempel, gel og/eller buffer. Den reduksjonsmiddel skiller obligasjoner innenfor RNA eller protein molekyl og dermed reduserer sin sekundær struktur. Den sekundære strukturen til et protein eller RNA vil påvirke, i en ikke-lineær måte, hvor fort det vandrer gjennom en gel., En denaturert, lineær form av RNA eller protein, men vil migrere proporsjonalt til sin lineær størrelse (som base par kilo eller dalton-brødrene). Denaturing gel elektroforese er ofte mer nøyaktig for størrelse identifikasjon, mens native gel elektroforese er vanligvis brukes til å identifisere større protein komplekser.
Eksempler på Gel Elektroforese
- TAE Agarose Gel Elektroforese er mest brukt for DNA.
- TBE-og Denaturing SIDE (polyakrylamid gel elektroforese) er felles for RNA-separasjon.,
- SDS SIDE er en denaturing gel elektroforese ofte brukt for protein identifikasjon og separasjon.