Frontiers i veterinærmedisinsk

Innledning

virvelløse Dyr omfatter om lag én million dyrearter holdes både i zoologisk institusjoner og i husholdninger hvor de er hånd hevet som eksotiske kjæledyr (1). Gastropods utgjør nesten 60.000 arter av vannlevende samt terrestrisk bløtdyr, først og fremst snegler og slugs (1). Den gigantiske Afrikanske land snegl (Achatina fulica, syn., Lissachatina fulica) er opprinnelig fra Øst-Afrika, men det er en utbredt invasive arter i Asia, Oseania, og mer nylig i Amerika, der det har blitt innført ved et uhell eller med vilje som matkilde og som et kjæledyr. Utgivelsen i naturlige økosystemer, landbruk og urbane områder har resultert i økologisk, helse og landbruks-trusler (2, 3). Den gigantiske Afrikanske land snegl er en mellomverter for flere parasitter inkludert Aelurostrongylus abstrusus, Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus costaricensis, Schistosoma mansoni, Hymenolepis spp., og Fasciola hepatica (4, 5). Alle de ovennevnte helminths, med unntak av A. abstrusus, er i stand til å forårsake alvorlige sykdommer hos mennesker. Spesielt, den gigantiske Afrikanske land snegl er den viktigste gastropod ansvarlig for global spredning av A. cantonensis som fører til menneskelig eosinofil meningoencephalitis i Asia og Amerika (2, 6). Risikofaktorer for infeksjon hos mennesker, dyr og dyreliv med de helminth parasitter inkluderer inntak av rå eller kokt infisert snegler eller snegler, eller mat som er forurenset av slim av infisert snegler eller snegler (4, 5, 7, 8).,

Selv om den gigantiske Afrikanske land snegler er blant de mest populære snegler holdt som kjæledyr, og deres popularitet over hele verden som eksotiske kjæledyr vokser raskt, bare noen få undersøkelser som har vært gjennomført på forekomsten av deres parasitter i naturlige forhold (2, 6, 9-11). Målet med denne undersøkelsen var å undersøke forekomsten av parasitter i gigantiske Afrikanske land snegler avlet som kjæledyr i sør-Italia.,

Materialer og Metoder

Generelle Data

I August 2018, tre bassenger av fersk fekal-prøver som er tatt fra en total av 60 gigantiske Afrikanske land snegler, holdt i tre ulike private samlinger ligger i Pozzuoli, Caserta, og Napoli (Italia), ble undersøkt for parasitter. Fra hver lokalitet fikk vi en pool av avføring fra 20 individuelle snegler hver. Sneglene er inkludert i denne undersøkelsen hadde en median alder på 1,6 år alt fra 0,2 til 2 år og ikke hadde mottatt noe tidligere anti-parasittiske behandling., Snegler var lei av ferske grønnsaker og frukt, i tillegg til kalsium pulver tilskudd (Kalsium, Exo Terra, Hagen Deutschland GmbH & Co. KG, Holm, Tyskland) ble gitt to ganger i uken. Alle dyr ble avlet frem i Italia, privateid og holdt som kjæledyr i fire innendørs glass av 60 × 30 × 45 cm i størrelse, i grupper på 10-20 dyr (2 grupper av 20 snegler i Pozzuoli, og Caserta-palasset og 2 grupper på 10 snegler hver i Napoli)., En organisk torv jord (Organisk Coco-Torv Jord, E-Coco Produkter, Gloucestershire, ENGLAND), tidligere varmebehandlet (100°C i 30 min) og deretter fri for parasitter og insekter, ble brukt som underlag.

Diagnostiske Prosedyrer

Tjue gram fersk avføring opprinnelig ble innhentet fra hver av de fire terrarium., Når samlet avføring analysert av ferskt smør, flotation og Baermann test viste positivitet til rhabditid nematoder, to snegler fra hver positiv terrarium var plassert individuelt i en steril plast-boksen, og deres avføring ble samlet inn, umiddelbart etter defecation, i et sterilt 50 ml plastrør. Coprological undersøkelse for sammensatte og individuelle prøver, inkludert fersk smør, sentrifugal flotation (2 g av avføring for hver test) ved hjelp av en løsning av sukker og formaldehyd (egenvekt 1.27) og Baermann test (10 g av avføring for hver test)., I tillegg slim som er oppnådd i løpet frisk smøre undersøkelsen ble analysert under et lys mikroskop. Fordi larval former for flere helminth arter kan encyst inne i foten muskler av snegler, histologisk undersøkelse av biopsi prøver høstet fra de fremre og bakre områder av foten muskler ble utført i 30 snegler, bedøvet med teknikken beskrevet av Giannelli et al. (12) og Gilbertson og Wyatt (13)., Biopsi prøvene ble fiksert i 10% nøytral fosfat-bufret formalin, og behandles av rutinemessige metoder i parafin blokker som var skåret i 3 µm tykke seksjoner, og farget med hematoksylin og eosin. Studien ble utført i henhold til tillatelse fra praksis hvor det fant sted og under signert, skriftlig informert eier samtykke.

Morfologiske Identifikasjon

Midlertidige festene var laget av varme-drapet nematoder på glass-slides i en dråpe vann, og etter et glass dekkglass ble brukt., Nematoder er overført til en dråpe av vann fra springen på et objektglass og plassert på varmeapparatet (100°C) 10 s. Disse prøver ble brukt for morfologiske identifikasjon. En AMPLIVAL lys mikroskop, Carl Zeiss Jena, og en Leitz Diaplan med Nomarski optikk ble brukt til observasjon., Morfologiske identifisering av rhabditid nematoder som følges Andrassy (14) og Andrassy (15), og det var for det meste basert på morfologi av strupehodet og stomien, og reproduktive system, hovedsakelig funksjonene i spicules, antall og posisjon av papillae eller tilstedeværelse og størrelse eller form av bursa for menn, og halen form, plassering av vulva og morfologi av reproduktive system for kvinner. Identifisering av larvene var basert på halen form.

Molekylær Analyse

DNA ble ekstrahert fra nematode prøver innhentet fra avføring fast i 96% etanol samlet inn fra tre lokaliteter., Nematoder ble vasket i dobbel-destillert vann (ddH2O) over natten, før den molekylære analyser, for fullstendig fjerning av rester av etanol. Hver enkelt nematode ble overført til et sterilt Eppendorf-rør (200 µl) med 20 µl av utvinning buffer (17.7 µl av ddH2O, 2 µl 10 × konsentrert PCR buffer, 0.2 µl av 1% Tween 20 og 0,1 µl av proteinase K). Buffer og nematoder var frosset ved -20°C i 20 min, og deretter umiddelbart inkubert ved 65°C i 1 time, etterfulgt av 10 min ved 95°C., Den lysates var nedkjølt på isen og så sentrifugerte (2 min, for 9000 g); 1 µl supernatant ble brukt for PCR.

Et fragment av rDNA inneholder interne transkribert spacer regioner (ITS1, 5.8 S, ITS2) ble amplifisert ved hjelp av primere 18: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′ (forover), og 28S: 5′-TTT CAC KORTSPILLET CCG TTA CTA AGG-3′ (revers) (16). Et fragment av rDNA som inneholder genet for 18S rRNA ble amplifisert ved hjelp av primere 22F: 5′- TCC AAG GAA GGC AGC AG GC-3′ (forover), og 1080JR: 5′- TCC TGG TGG TGC CCT TCC GTC AAT TTC-3′ (revers) (17). PCR master mix besto av: ddH2O, 7.,25µl; 10 × PCR buffer, 1.25 µl; deoxynucleoside triphosphates (dntp), 1 µl; 0.75 µl av både forover og i revers primer; polymerase, 0.1 µl; og 1 µl DNA-ekstrakt. PCR-profiler ble brukt som følger: for SIN 1 syklus av 94°C i 7 minutter etterfulgt av 35 sykluser av 94°C i 60 s, 50°C til 60 s og 72°C i 60 s, og en siste strekning på 72°C i 7 minutter (14); for 18 1 syklus av 94°C i 5 min, etterfulgt av 35 sykluser av 94°C i 60 s, 55°C for 90 s og 72°C i 2 min og en siste strekning på 72°C i 10 min., PCR-produktene ble sekvensert av GATC Biotech (Tyskland) og senere redigert og lastet opp til GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

Resultater

Baermann-test viste tilstedeværelse av nematode larver, hvis lengde varierte fra 170 til 336 µm, i alle prøvene. Egg, larver og voksne rhabditid nematoder ble oppdaget av fersk smør og flotation metoder i alle fekal prøver. Rhabditella axei (Figur 1) ble identifisert morphologically fra to av tre sammenslåtte og individuelle fekal prøver fra Pozzuoli og Napoli. I tillegg, Rhabditis terricola, Cruznema sp., og Pristionchus entomophagus ble isolert fra en pool og individuelle fekal prøver fra Caserta. Ingen parasitter ble oppdaget i muskel biopsi prøver eller i livmorhalsen.

Flere morfologiske typer rhabditid nematoder var isolert fra snegl avføring fast i 96% etanol. Hentet og redigert sekvenser av SIN og 18 av disse nematoder ble sammenlignet (BLAST) med materialet i GenBank og identifisert som R. axei (delvis 18S, aksesjonsnummer MK124578, likhet 99%), Rh., terricola (delvis 18 og delvis ITS1, aksesjonsnummer MK156052, likhet 100%), S. entomophagus (delvis 18 og delvis ITS1, aksesjonsnummer MK156050, likhet 99%) og Cruznema sp. (delvis 18 og delvis ITS1, aksesjonsnummer MK156051, likhet 96-100%).

Diskusjon

resultatene av denne studien tyder på at alle de undersøkte gigantiske Afrikanske land snegler legger egg, larver og voksen rhabditid nematoder i avføringen, og kan derfor representere en kilde for smitte til andre dyr og mennesker. For å unngå feilidentifisering med Strongyloides sp., en nematode arter som viser nær likhet med rhabditids som har en klar parasittiske zoonotic relevans (14, 15, 18), den første morfologisk diagnose av rhabditid nematoder ble bekreftet gjennom molekylære analyser.

Rhabditidae inkluderer gratis-levende saprophytic nematoder, mye som finnes i jord og organisk materiale der de beiter hovedsakelig på bakterier. Mange arter av snegler, kan tjene som et siste definitive verter for rhabditid nematoder (14, 15). Men en del av Rhabditis og Rhabditella arter har vært forbundet med vertebrater inkludert mennesker (14, 15, 19-27)., Selv om deres tilstedeværelse kan være et resultat av forurensning i miljøet unngås, disse nematoder kan forårsake sykdommer hos mange dyr og mennesker. Rhabditis elongata, Rh. hominis, og Rh. usuii larvene har blitt isolert fra menneskelig avføring, urin og vaginale vattpinner (19-21). Likevel, ikke mange tilfeller av symptomatisk infeksjoner er rapportert hos mennesker (21-24). Feng Li (25), som er beskrevet to mennesker tilfeller av urinveisinfeksjon ved R. axei i Kina, og Synger et al. (20) rapportert fem humane tilfeller av intestinal infeksjon med Rhabditis sp. i landlige skolebarn i Sør-Korea., På samme måte, to tilfeller av human intestinal infeksjon av R. axei ble beskrevet i Kina (26), mens en annen publisert arbeid (21) rapportert et tilfelle av intestinal infeksjon i 5 måneder gamle Brasilianske barn som ble presentert med feber og rennende og blodig diaré; coprological undersøkelse avslørte egg, larver og voksne av Rhabditis sp. Meamar et al. (27), som er beskrevet forekomst av vannaktig diaré i to Iranske pasienter med AIDS, knyttet til alvorlig tarminfeksjon av larver og voksne individer av R. axei. Til slutt, Teschner et al., (24) er nylig beskrevet et tilfelle av ytre øregangen infeksjon i en 37 år gamle mannen som er presentert med purulent otorrhea fra både ører og akutt hørselstap forårsaket av Rhabditis sp. Generelt, Rhabditis spp. ansees for å være en vanlig årsak til ytre ørebetennelse i storfe lever i tropiske områder (f.eks., sør-Amerika og Afrika), spesielt hos eldre dyr, og har blitt identifisert også i kyllinger, hunder og griser med incoercible diaré (18, 28-30). Imidlertid, asymptomatiske infeksjoner har også blitt beskrevet og disse nematoder er ofte betraktet som pseudoparasites (28, 29).,

Selv om frittlevende nematoder ble hentet i alle fekal prøver, ingen prøver ble funnet i slim og histologiske prøver. En mulig forklaring på dette funnet er at nematoder kan finne i forskjellige vev/organer av sine verter, avhengig av association nematode/mollusk vert (15, 31, 32). Rhabditis spp. fullføre sin livssyklus inne snegl, uten å skade sin molluscan vert. Tidligere studier på gratis-alt Afrikanske snegler (Archachatina spp. og Achatina spp.) avslørte at R., axei liv i mage-tarmkanalen av snegl vert der hele nematode liv syklusen er ferdig (31-33).

Selv om Afrikanske gigantiske snegler er oppført som verter for R. axei, forekomst av denne nematode hadde blitt rapportert bare i noen få arter av gigantiske Afrikanske snegler, andre enn A. fulica, nemlig Archachatina marginata egget, og Ar. marginata saturalis, og Achatina achatina (31). På den annen side, S. entomophagus har et verdensomspennende distribusjon og har i hovedsak vært knyttet til møkk biller som hører til superfamily Scarabaeoidea (34, 35), R., terricola har blitt funnet i salamanders (14, 15) og Cruznema spp. i cricket Gryllodes laplatae (Orthoptera) (36). I alle tilfeller, overføring av parasitten skjer gjennom kontakt med snegler med forurenset fuktig jord som er rik på nedbrytbart organisk materiale (31, 37). Selv om det i den foreliggende tilfeller alle dyrene ble holdt i terraria med en varme-behandlet organisk jord, vi spekulerer i at smitte kan ha skjedd før kjøp av dyr i dyrebutikker eller avl fasiliteter.,

I en konklusjon våre resultater tyder på at pet gigantiske Afrikanske land snegler, kan tjene som et reservoar av flere rhabditid nematoder. Dette snegl arter er blant de som oftest de holdt som kjæledyr, og derfor lever ofte i nær tilknytning til mennesker. Som et resultat, forurensning i innemiljø gjennom deres avføring er mulig. Selv om parasittiske nematoder ikke var isolert i denne studien, gigantiske Afrikanske land snegler skal fortsatt betraktes som potensielle bærere av nematoder i stand til å forårsake opportunistiske sykdommer hos mennesker., Derfor vil vi fremheve viktigheten av videre epidemiologisk forskning på forekomst av frittlevende og parasittiske nematoder i gastropod snegler holdt i fangenskap, og understreke behovet for strenge kontrolltiltak for å redusere risikoen for opportunistisk infeksjon med rhabditid nematoder i pet snegl eiere.

Forfatter Bidrag

Dd ‘ O og MS gjennomtenkt og planlagt analysen. MS og JOH gjennomført analysen. CA bidro til å forme forskning og redigert manus. Alle forfattere gitt kritiske tilbakemeldinger og bidratt til det siste manuskriptet.,

interessekonflikt Uttalelse

forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller finansielle forhold som kan oppfattes som en potensiell interessekonflikt.

PubMed Abstrakt | Google Scholar