Oppdagelsen av SmacCas9
Hvis du vil endre forfedres 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) PAM spesifisitet av SpyCas9, tidlig og senere rapporter har ansatt rettet utviklingen (f.eks., «VQR», «EQR», «VRER», og «NRNH» – varianter) eller rasjonell design informert av krystall struktur (f.eks., «QQR», «A», og «NR» – varianter)17,18,19,20,21,22. Disse rapportene fokusert på PAM-kontakter arginin rester R1333 og R1335 som avskaffe funksjon når utelukkende mutert., Mens de studiene som er identifisert risikoreduserende mutasjoner resulterer i endret PAM spesifisitet, det Cas9 varianter som de produserte opprettholdt en guanin preferanse i minst en posisjon av PAM rekkefølge for rapporterte in vivo-redigering. Samtidige rapporter har brukt evolusjonære informasjon for ytterligere å slappe av den kanoniske 5\(^{\prime}\)-NNGRRT-3\(^{\prime}\) PAM spesifisitet av Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) eller å oppdage alternativ 5\(^{\prime}\)-NNNNCC-3\(^{\prime}\) PAM spesifisiteten til de kanoniske 5\(^{\prime}\)-NNNNGHTT-3\(^{\prime}\) PAM av Neisseria meningitidis Cas923,24., Den nucleases fra begge disse nye rapporter, men fortsatt foretrekker GC-innhold i minst en posisjon av PAM rekkefølge. Vi tok sikte på å løfte slike GC-innhold forutsetninger via en tilpasset bioinformatikk-drevet arbeidsflyt som gruver eksisterende PAM mangfold i Streptokokker genus25. Ved hjelp av denne strategien, og vi home inn på SmacCas9 som å ha potensial til å bære endret ikke-GC PAM spesifisitet ved å justere 115 orthologs av SpyCas9 fra UniProt (begrenset til de med mer enn 70% parvis BLOSSOM62 score)., Fra justeringen vi fant SmacCas9 var en av to nære homologs, sammen med en Streptococcus mutans B112SM-EN Cas9 (SmutCas9), og som har glutamines på begge posisjoner justert i forhold til den ellers svært bevart PAM-kontakter arginines (Fig. 1a–b; Supplerende Fig. 2A). Arginin rester er kjent for å sterkt foretrekker guanines i amino-syre-base samhandling landskapet, noe som gjenspeiles av 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) spesifisitet av SpyCas9. Glutamin rester, på den annen side, fortrinnsvis binde seg til adenines, gjennom interaksjon med de store groove edge26., Dermed har vi en hypotese om at SmacCas9 hadde naturlig coevolved de nødvendige kompenserende mutasjoner å få nye adenine-rik PAM anerkjennelse. Et lite eksempel størrelse på 13 avstandsstykker fra den tilsvarende genom er CRISPR utvalg hindret oss fra trygt inferring den SmacCas9 PAM i silico., Likevel, muligheten for SmacCas9 krever mindre GC-innhold i sin PAM ble støttet av sekvensen likheter til «QQR» – variant som har 5\(^{\prime}\)-NAAG-3\(^{\prime}\) specificity27, i tillegg til at-rike antatte konsensus PAM for phage-stammer avstandsstykker i CRISPR matriser som er forbundet med svært homologe SmutCas9, som ble identifisert med hjelp av våre tidligere beskrevet SPAMALOT rørledningen og i samsvar med tidligere spådommer (Fig. 1c; Supplerende Fig. 2B; Supplerende Fig. 3) 25,28.
en Sekvens justering av SpyCas9, sin QQR variant, og SmacCas9. Trinn i understrekingen rød linje markerer å bli med på SpyCas9 og SmacCas9 å konstruere en SpyMac hybrid. Sekvensen logo (Weblogo online verktøy) rett under justeringen viser bevaring på 11 posisjoner rundt PAM-kontakter arginines av SpyCas9., b domenet organisering av SpyCas9 settes opp mot hverandre over et fargekodet struktur av RNA-veiledet, mål-bundet SpyCas9 (PDB-ID 5F9R). De to DNA-trådene er svart, med unntak av en magenta segmentet tilsvarer PAM. En blå–grønn–rød farge kart er brukt for å merke Cas9 PI domene og guide-spacer rekkefølge for å markere strukturer som gir sekvensen spesifisitet og prevalens av intra-domene kontakter innen PI43. c En sekvens logo generert online (WebLogo) som ble inngang med antatte PAM sekvenser funnet i Streptokokker phage og forbundet med nær SmacCas9 homologs.,
Engineering og PAM karakterisering av SpyMac
Vi fortsatte å empirisk bestemme PAM preferanser av flere Streptokokker orthologs som endrer en eller begge av de kritiske PAM-kontakter. Basert på påvist eksempler på PAM-interaksjon domene (PID) og guide-RNA (gRNA) har cross-kompatibilitet mellom Cas9 orthologs som er nært i slekt og aktive, har vi konstruert nye varianter av rasjonelt å utveksle PI-regionen catalytically «døde» SpyCas9 (dSpyCas9) med de valgte orthologs (Supplerende Fig., 2A–B)29,30. Samlet varianter, inkludert dSpyMacCas9 (her referert til som dSpyMac), var separat cotransformed inn i E. coli-celler, sammen med guide RNA avledet fra S. pyogenes og en 8-mer PAM bibliotek av uniform base representasjon i PAM-SCANR genetisk krets, etablert av Leenay et al.31. Kretsen upregulates et grønt fluorescerende protein (GFP) reporter i forhold til PAM-bindende styrke. Derfor har vi samlet de GFP-positiv celle bestander av flowcytometri (Supplerende Fig., 4) og Sanger sekvensert dem rundt på siden av PAM å fastslå posisjonen-messig base preferanser i en tilsvarende variant er PAM anerkjennelse. dSpyMac, mer så enn dSpyMutCas9, generert et spor profilen som var mest i samsvar med guanin-uavhengig PAM anerkjennelse, sammen med en dominerende spesifisitet for adenine dinucleotides (Fig. 2a; Supplerende Fig. 2C).
en Chromatograms som representerer PAM-SCANR basert berikelse av variant-gjenkjenne PAM sekvenser fra en 5\(^{\prime}\)-NNNNNNNN-3\(^{\prime}\) bibliotek. b SYBR-farget agarose gel som viser in vitro fordøyelsen av 10 nM 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) underlag på 16 minutter inkubering med 100 nM renset ribonucleoprotein enzym forsamlinger. Pilene skille banding av spaltet produkter fra uncleaved substrat (topp band)., Matrix tomter oppsummere spaltet brøkdel beregninger som ble utført i et egendefinert skript for behandling gel bilder. Prøvene ble utført i selvstendig biologiske duplikater (n = 2). c Tid selvfølgelig målinger av mål-DNA substrat spalting for SmacCas9 og SpyMac. d DNA-substrat spalting plottet som en funksjon av 0.25:1, 1:1 og 4:1 molar prosenter av ribonucleoprotein til mål for vill-type SpyCas9 og hybrid SpyMac. Kilde data er gitt som en Kilde for Data-fil.,
Neste, vi renset nuclease-aktive enzymer til å fortsette undersøkelse av DNA-mål anerkjennelse potensial og unikhet av SpyMac. (Supplerende Fig. 5A)27,32. Vi individuelt inkubert den ribonucleoprotein komplekse enzymer (sammensatt av Cas9 + crRNA + tracrRNA) med dobbel-strandet mål underlag av alle 5\(^{\prime}\)/3\(^{\prime}\)-nabokommunene base kombinasjoner på en adenine dinucleotide PAM (5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\); Fig. 2b)., En kort 16-min fordøyelse angitt både vill-type SmacCas9 og hybrid SpyMac spaltet i tilknytning til 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) motiver mer bredt og jevnt enn det som tidligere er rapportert QQR variant. SpyMac utmerker seg videre med raske DNA-kutte priser som ligner rask fordøye kinetikk for SpyCas9 (Fig. 2c–d)33. Vi kjørte reaksjoner som brukes varierende crRNA spacer lengder og tracrRNA sekvens, som sistnevnte varierer noe mellom S. macacae og S. pyogenes genomer (Supplerende Fig. 5B–E)., Ingen av disse to parameterne kompensert for lavere spalting pris av SmacCas9, men vi la merke til marginal forbedring i aktiviteten av vill-type form med sin opprinnelige tracrRNA, som comports med grensesnitt av guide-Cas9 samhandling blir det meste utenfor PI domene.
Genom redigering med iSpyMac
en CRISPResso2 indel analyse følgende NGS av forsterket genom regioner for å vurdere om mål redigering av iSpyMac i forhold til SpyMac og SpyCas9, på den angitte 5\(^{\prime}\)-NAA-3\(^{\prime}\), og 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) PAM-sekvenser. Prøvene ble utført i to uavhengige transfection replikater (n = 2). b Effektivitet heatmap av mismatch-toleranse analyse på genomisk mål., Kvantifiseres indel frekvenser, som vurderes av TIDEVANNET algorithm41, er utstilt for hver merket enkelt-eller dobbeltrom mismatch i sgRNA sekvens for den angitte Cas9 variant og indikert PAM rekkefølge. Prøvene ble utført i to uavhengige transfection replikater (n = 2). c CRISPResso2 genom-base-redigering analyse følgende NGS av genomisk amplikoner å vurdere konvertering av cytosines å thymines av iSpyMac-BE3. Prøvene ble utført i to uavhengige transfection replikater (n = 2). Alle kilde data er gitt som en Kilde for Data-fil.,
Neste, vi vurderte toleranse av iSpyMac til feilaktige sekvenser, ved å ansette sgRNAs husing dobbel eller enkel samsvarer ikke til en fast protospacer innenfor AAVS gen, og som har et 5\(^{\prime}\)-GAAG-3\(^{\prime}\) PAM rekkefølge. iSpyMac vist redigering evner på målene med single samsvarer ikke i PAM-proksimale segment av sgRNA., For å bøte på dette ment off-target tilbøyelighet introduserte vi R691A mutasjon, som tidligere var isolert via bakteriell utvalget for SpyCas9 å opprettholde høy-på-mål-aktivitet og samtidig redusere off-target editing35. Vår hifi-variant, HiFi-iSpyMac, utstilt nesten ubetydelig aktivitet på feilaktige sekvenser, i forhold til den opprinnelige enzym, med minimalt tap av på-mål-aktivitet (Fig. 3b).,
til Slutt, vi valgte et vindu av fire nukleotider i VEGFA locus i en sekvens sammenheng slik at andre CRISPR endonuclease med rapportert bruk for base-redigering ikke ville tillate sin base redigering med en cytidine deaminase smeltet enzyme36. Følgelig, vi cotransfected HEK293T celler med en nickase form av iSpyMac avledet fra det som tidligere er rapportert BE3 arkitektur for cytosine base-redigering (iSpyMac-BE3) og sgRNA plasmider mot en PAM nedstrøms for den valgte nucleotides5., Vi målte effektiv base-redigering nivåer i fisket celler, der de stilte ut over 20% cytosine til innhold av tymin konvertering på disse posisjonene via NGS analyse (Fig. 3c).