Un nuovo protocollo di urina artificiale per imitare meglio l'urina umana / Rapporti scientifici

In pratica, trovare una vera corrispondenza spettrale tra qualsiasi UA e urina umana è impossibile, ma il grado di somiglianza è una misura affidabile. Tre lotti AU vengono confrontati in termini di SG, pH e spettro IR come misurazione della corrispondenza con l’urina umana. Un’analisi statistica viene applicata anche sugli spettri IR. Dopo l’acqua, il componente principale dell’urina è l’urea., In effetti, il contributo spettrale dell’urea all’AU è dominante rispetto ad altri componenti (Fig. 1 e Fig. S2). Creatinina e citrato di sodio sono il secondo e il terzo componente con profondi contributi spettrali.

BK-AU, CT-AU e MP-AU sono preparati come descritto nel Metodo. BK-AU e CT-AU condividono sostanze chimiche comuni nei loro protocolli., Tuttavia, mentre entrambi includono bicarbonato, questo composto non si trova naturalmente in urine1 umano sano. Pertanto, il bicarbonato non è stato utilizzato nella formulazione MP-AU. Le concentrazioni di sostanze chimiche sono diverse quando vengono confrontate BK-AU e CT-AU poiché i due studi si basano su letteratura diversa per quanto riguarda la composizione delle urine. Nonostante le differenze nelle formule, tutte le AU hanno proprietà fisiche accettabili in termini di SG e pH (Tabella 3) e tutti gli ingredienti rientrano negli intervalli fisiologici basati sul catalogo dei test della Mayo Clinic., D’altra parte, l’urina è una soluzione complessa per natura e confrontare qualsiasi formulazione AU con l’urina umana basata su due soli parametri (SG e pH) è al massimo un approccio cieco. Pertanto, abbiamo utilizzato un’analisi spettroscopica utilizzando FTIR per evidenziare somiglianze e / o differenze tra AUS e confrontarle con campioni di urina umana.

Tabella 3 Proprietà fisiche di tutte le AUS. Fare riferimento al testo per le abbreviazioni utilizzate nella tabella.,

Urina umana

Gli spettri di assorbanza dei campioni di urina di 28 individui sani sono mostrati in Fig. 2. Generalmente, gli spettri dell’urina umana mostrano lo stesso profilo, in particolare nella finestra 1800-1200 cm−1 dello spettro. Tuttavia, ci sono variazioni significative tra gli individui nella gamma 1200-800 cm−1. Può essere dovuto a differenze di dieta, genere e metabolismo. Quando viene calcolata la varianza, i picchi più importanti sono visti come 1644, 1574, 1436, 1105 e 1065 cm−1., Secondo il nostro database di spettri ottenuti da singoli ingredienti (Fig. 1), le variazioni nel livello di creatinina, citrato, urea, fosfato e acido urico possono aver contribuito a queste differenze insieme ad altri componenti dell’urina. La media di 28 campioni di urina viene calcolata e utilizzata di seguito per il confronto (Fig. 2).

Urina artificiale

L’urina umana media calcolata viene confrontata con i tre spettri AU come mostrato in Fig. 3. I profili e le posizioni delle bande sono simili in molti punti, vale a dire 1657, 1609, 1447, 1143 e 783 cm−1 (Fig. 3). Queste bande provengono principalmente dall’urea. Tuttavia, ci sono anche variazioni significative e deviazioni da queste posizioni come discusso in dettaglio in quanto segue.,

Tutti gli spettri condividono caratteristiche comuni nella regione di frequenza più alta (4000-2500 cm-1) (Fig. 3-ingresso)., I due assorbimenti più alti centrati intorno a 1600 cm-1 e 1445 cm-1 sono principalmente dovuti all’urea con un contributo relativamente minore della creatinina. Le lievi differenze nell’assorbanza di AUS sono dovute principalmente alle differenze nella concentrazione di urea nelle rispettive formulazioni. D’altra parte, la regione tra 1200 cm−1 e 800 cm−1 mostra variazioni significative. La differenza più importante è l’assorbanza a 975 cm-1 in BK-AU (Fig. 3). In questa posizione, tutti gli spettri AU hanno un numero diverso di picchi in posizioni diverse., Questa regione è la raccolta di una serie di picchi provenienti principalmente da urea, acido urico, creatinina e fosfato di sodio (Fig. 1 e Fig. S2). Pertanto, le leggere variazioni nella concentrazione di questi composti producono un profilo molto diverso nello spettro.

Principal Component analysis (PCA) viene utilizzato per la differenziazione di tre spettri urinari artificiali medi rispetto all’urina umana media nell’intera regione del numero d’onda (4000-600 cm−1) (Fig. 4 BIS). La prima componente principale (PC1) (72,7%) e la seconda componente principale (PC2) (19.,5%) rappresentano il 92% della varianza totale. Il grafico del punteggio mostra che MP-AU mostra una maggiore somiglianza con l’urina umana media rispetto ad altre formulazioni AU quando vengono presi in considerazione gli spettri interi. Questa analisi si applica anche a tutte e tre le misurazioni per AUS e a tutte le misurazioni delle urine umane di 28 individui sani. I confronti sono mostrati in due regioni dello spettro IR, cioè 1400-1200 cm-1 (Fig. 4B) e 1000-800 cm-1 (Fig. 4 QUATER). In entrambe le regioni, MP-AU ha più successo nell’imitare le caratteristiche spettrali dell’urina umana., Mentre BK-AU ha più successo rispetto a CT-AU nella regione 1400-1200 cm-1, è l’opposto nella regione 1000-800 cm−1. Quali bande o composti rappresentano queste differenze sono discussi nelle sezioni seguenti.

Confronto tra urina umana e MP-AU

Esiste una corrispondenza soddisfacente tra lo spettro di MP-AU e urina umana quando vengono confrontati l’assorbimento (traccia grigia) e i profili di derivati secondari (traccia rossa) (Fig. 5 BIS, lettera B). Due spettri non sono significativamente diversi al livello 0.05 basato sul test di Mann-Whitney (Z = -1) (Tabella supplementare S3). La regione tra i 1800-1400 cm-1 è quasi comune come suggerito dai profili derivati secondi., Tuttavia, il picco a 1390 cm-1 è diverso. L’assorbimento (traccia grigia) a questo punto in MP-AU non è elevato come nelle urine. Questo assorbimento è dovuto alla presenza di citrato di sodio (Fig. 1 e Tabella supplementare S2). Sebbene la quantità di citrato sia il valore medio dell’intervallo fisiologico, la mancata corrispondenza può indicare una grande quantità di citrato nei volontari. La concentrazione di citrato nelle urine può variare a seconda della dieta., Ad esempio, nella dieta DASH (Approcci dietetici per fermare l’ipertensione) (ricca di verdure, frutta, cereali integrali, alimenti a basso contenuto di lipidi, pesce, carne, noci e fagioli; limitato in carne rossa, frutta zuccherata, bevande e grassi) la quantità di citrato aumenta nelle urine37.

I picchi a 1343, 1301, 1278 e 1242 cm-1 sono quasi gli stessi in posizione (Fig. 5B-traccia grigia) e in termini di rapporto relativo di ampiezze, tranne che il picco a 1301 cm-1 è meno evidente dallo spettro di assorbanza. MP-AU offre la migliore corrispondenza in questa regione 1350-1200 cm−1 rispetto ad altri AUS., Nella regione 1200-1000 cm-1, invece del picco 1031 e 1045 cm−1 nell’urina umana (Fig. 5A-traccia rossa), c’è un picco a 1039 cm-1 in MP-AU (Fig. 5B-traccia rossa). La corrispondenza spettrale tra i due spettri nella regione 1000-600 cm-1 è soddisfacente. Una differenza è in posizione 928 cm-1 nello spettro di assorbimento delle urine. Questa band si trova a 922 cm−1 in MP-AU. Quando vengono esaminati i profili delle derivate seconde, questo picco è visto come la sovrapposizione di due picchi. Il principale contributore è un picco a 929 cm-1, con un contributo minore da un altro picco a 916 cm−1 nello spettro delle urine., Tuttavia, in MP-AU l’ampiezza dell’assorbimento di 929 cm-1 è inferiore, il che sposta la posizione dell’involucro fino a 922 cm−1. Ciò potrebbe essere dovuto al ricco contenuto di urina umana che fornisce assorbitori aggiuntivi a 929 cm-1 che non sono inclusi in MP-AU.

Urina umana e confronto CT-AU

La regione 1800-1400 cm-1 dello spettro di assorbanza è molto simile allo spettro di urina nella stessa regione, che è principalmente correlata al contenuto di urea (Fig. 5 BIS, lettera C). Lo spettro CT-AU è anche riuscito a abbinare la spalla a 1390 cm-1., La gamma fisiologica normale per il citrato è 0.2-1.2 g / d31. Nella formulazione CT-AU, la quantità di citrato corrisponde a 2 g / d (assumendo 1,5 L di minzione al giorno), che è superiore al punto massimo dell’intervallo fisiologico. Sembra che lo spettro medio delle urine rifletta una grande quantità di citrato come indicato nella sezione precedente. Quando l’intera regione dell’impronta digitale dello spettro CT-AU viene confrontata con lo spettro delle urine umane utilizzando il test Mann-Whitney, a livello 0.05, due spettri sono significativamente diversi (Z = -13.5) (Tabella supplementare S4).,

Nello spettro delle urine umane, la banda a 1238 cm−1 è vista essere localizzata a 1246 cm-1 nello spettro CT-AU (Fig. 5C-traccia rossa). Ciò che rimane poco chiaro, tuttavia, è se le due bande riflettono la vibrazione dello stesso gruppo molecolare, o sono assorbimenti non correlati. L’urina umana ha assorbenze multiple nella regione 1200-1000 cm-1. Sebbene la maggior parte dei componenti sia comune tra urina e CT-AU, vi sono differenze significative in termini di rapporti relativi delle bande e, quindi, il profilo generale è diverso., Le posizioni di picco sono generalmente simili, tranne quella a 1045 cm−1 nello spettro delle urine, che si trova a 1050 cm-1 in CT-AU. Inoltre, il picco a 1031 cm−1 manca nello spettro CT-AU. La differenza di ampiezza più prominente è a 1107 e ~1070 cm-1. Una quantità insufficiente di composti fosfatici, creatinina e acido urico potrebbe aver contribuito alla differenza in queste posizioni. La regione è una sovrapposizione di molti gruppi vibrazionali presenti in varie formazioni molecolari come lipidi, proteine, glucosio e suoi derivati e negli acidi nucleici., Pertanto, abbinare uno spettro AU con quello dell’urina umana è quasi impossibile in questa regione 1200-1000 cm−1. Un’altra differenza importante è il picco a 965 cm−1 visto in CT-AU, ma non nello spettro delle urine umane. Non abbiamo dati sufficienti per discutere la possibile causa di questa banda poiché nessuno dei componenti dell’urina che abbiamo misurato assorbe in questa posizione. L’ultimo punto nel confronto di CT-AU con urina umana è l’assenza di picchi di 928 e 866 cm−1 in CT-AU.,

Confronto urina umana e BK-AU

Il profilo spettrale generale di BK-AU è anche simile all’urina umana in molti punti (Fig. 3). Le tre assorbanze più alte nelle posizioni 1657, 1609 e 1447 cm-1 nello spettro delle urine umane corrispondono in termini di aspetto generale, ma variano leggermente nella posizione di picco nello spettro di BK-AU (Fig. 5A, D-tracce grigie). Tuttavia, il picco a 1491 cm-1 (visto come una spalla sul picco 1446 cm−1 nello spettro di assorbanza) è più pronunciato in BK-AU. Questa posizione potrebbe essere attribuita alla creatinina (Fig. 1 e Tabella supplementare S2)., La quantità di creatinina utilizzata nella formulazione di BK-AU rientra nel normale intervallo fisiologico sebbene sia inferiore al valore medio. Infatti, la quantità di creatinina nella formulazione MP-AU è maggiore, ma l’assorbanza a ~1490 cm−1 è inferiore. Pertanto, un picco così pronunciato non può essere spiegato dalla quantità di creatinina. D’altra parte, abbiamo osservato un aumento di ampiezza in questa posizione quando il solfato di sodio viene aggiunto alla soluzione durante la preparazione di MP-AU, sebbene il solfato di sodio non abbia un’assorbanza in questa regione. Il solfato di magnesio non crea questo effetto., Sulla base di questa esperienza, crediamo che l’aumentata assorbanza a ~1490 cm−1 sia correlata alla quantità di sodio nella formulazione di BK-AU. La concentrazione totale del sodio utilizzata nella formulazione di BK-AU è oltre la gamma fisiologica ed è il massimo fra le tre AUs. Un confronto dettagliato dei contenuti chimici è presentato nella prossima sezione.

Una mancata corrispondenza dei profili spettrali tra BK-AU e urina è vista a ~1390 cm-1 (Fig. 3). L’ampiezza in questa posizione è più nello spettro delle urine. Questo picco è stato attribuito al citrato nelle sezioni precedenti., Tuttavia, molti modi vibrazionali CH assorbono anche in questa regione come la modalità di deformazione simmetrica del gruppo metilico a 1380-1390 cm−138,39. Nell’urina umana, ci sono un certo numero di fonti CH3 insieme alla creatinina1, come 3-metilistidina, acido acetico, acetone, acido alfa-idrossiisobutirrico, 5-metil-2-esanone, ecc. che contribuiscono all’assorbimento a 1390 cm-1. La mancanza di tali composti avrebbe potuto portare all’ampiezza inferiore a 1390 cm-1.

Il picco di 1345 cm−1 nello spettro delle urine umane si trova a 1341 cm−1 nello spettro BK-AU (Fig. 5A, D-tracce rosse)., Questa banda proviene principalmente da urea (1331 cm−1), acido urico (1346 cm−1) e creatinina (1333 cm−1) e riceve un contributo minore dal citrato di sodio (Tabella supplementare S2). Nella formulazione di BK-AU, la concentrazione di urea è compresa nella prima porzione del 20% del normale intervallo fisiologico, che è piuttosto inferiore al valore medio. Le concentrazioni di acido urico e creatinina sono anche inferiori alla media cioè, 13,5% e 33,5% porzione, rispettivamente., La differenza nella posizione della banda è dovuta ai diversi rapporti di questi componenti l’uno rispetto all’altro, in modo che la banda sovrapposta sia leggermente spostata in posizione. Un’altra differenza nello spettro di BK-AU è il picco situato a 1246 cm-1 (Fig. 5D). Nello spettro urinario umano questo picco si trova a 1238 cm−1. Sfortunatamente, non è chiaro se le due bande sono dovute allo stesso gruppo molecolare e c’è uno spostamento di posizione, o le due bande provengono da diversi gruppi molecolari. Lo stesso picco si osserva anche in CT-AU, come sottolineato in precedenza., Inoltre, il problema nella regione 1200-1000 cm−1 visto in CT-AU è anche osservato in BK-AU. Come accennato in precedenza, una corrispondenza perfetta in questa finestra dello spettro è quasi impossibile a causa del numero di ingredienti necessari per un AU economico.

La più grande differenza nello spettro di BK-AU è l’assorbimento relativamente eccessivo centrato a ~975 cm−1. Questa banda è una sovrapposizione di cinque diversi componenti a 999, 984, 963, 945 e 909 cm−1 come rivelato dal profilo derivato secondo dello spettro., Un picco simile si osserva anche in CT-AU a 965 cm−1, ma l’ampiezza della banda è molto più piccola di quella nello spettro BK-AU. Nell’intervallo tra 940-1020 cm−1, il bicarbonato, l’idrogeno fosfato di sodio e l’urea hanno assorbimenti (Fig. 1 e Fig. S3). Quando vengono aggiunti gli spettri di assorbimento individuali di questi tre composti (aggiunta spettrale), l’ampiezza risultante nella regione corrispondente è molto inferiore a quella osservata in BK-AU. Ciò dimostra la formazione di un composto tra i costituenti.,

Il picco a 866 cm−1 nello spettro delle urine manca in BK-AU, come nel caso di CT-AU. L’ultima differenza tra i due spettri è a 841 cm−1 nello spettro BK-AU. Questo picco è più pronunciato nello spettro BK-AU rispetto agli spettri CT-AU e urina umana. È principalmente dovuto alla creatinina (842 cm−1). Il solfato di magnesio contribuisce anche con una linea di base, dando alla banda la sua posizione e profilo finale per quanto abbiamo osservato durante i nostri esperimenti., In BK-e CT-AU, il bicarbonato assorbe anche a 832 cm-1 che contribuisce all’ampiezza ma non cambia la posizione del picco 841 cm−1.

Nell’intera regione delle impronte digitali, gli spettri di BK-AU e urina umana sono significativamente diversi al livello 0.05 basato sul test di Mann-Whitney (Z = -10.8) (Tabella supplementare S5).

Confronto delle urine artificiali in termini di contenuto chimico

L’elenco delle sostanze chimiche utilizzate in tutte e tre le UA è principalmente lo stesso; tuttavia, la concentrazione di ciascun componente è diversa (Tabella supplementare S1)., La figura 6 mostra la quantità di ciascun componente rispetto al suo normale intervallo fisiologico31. MP-AU comprende tredici componenti, ciascuno al livello del 50%, che è la media del normale intervallo fisiologico. Un valore negativo nella figura rappresenta una quantità insufficiente della sostanza chimica corrispondente. La composizione chimica della formulazione CT-AU presenta carenze. Per cominciare, la quantità di citrato supera l’intervallo normale (~125%). Allo stesso modo, la quantità di calcio e cloruro è superiore ai valori medi, rispettivamente 90% e 64%., Mentre la creatinina e il fosfato sono insufficienti, la quantità di urea, acido urico, ammonio, magnesio e solfato sono vicini ai valori minimi degli intervalli normali. Nella formulazione di BK-AU, la quantità di sodio, calcio e cloruro è superiore ai valori medi, rispettivamente 87%, 75% e 76%. D’altra parte, urea, acido urico, potassio, magnesio, solfato e fosfato sono piuttosto inferiori alla media del normale intervallo fisiologico. Sebbene questi composti siano ancora all’interno del range normale per un essere umano sano, la quantità di ossalato è insufficiente.,

Un nuovo protocollo di urina artificiale per imitare meglio l’urina umana