Un Cas9 con PAM riconoscimento per adenina dinucleotidi

Scoperta di SmacCas9

Per modificare l’ancestrale 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) PAM specificità di SpyCas9, primi e i rapporti recenti hanno impiegato diretta evoluzione (ad esempio, “VQR”, “EQR”, “VRER”, e “NRNH” varianti) o progettazione razionale informato dalla struttura cristallina (ad esempio, “QQR”, “NG”, e “NR” varianti)17,18,19,20,21,22. Questi rapporti si sono concentrati sui residui di arginina a contatto con PAM R1333 e R1335 che aboliscono la funzione quando sono mutati esclusivamente., Mentre tali studi hanno identificato mutazioni compensatorie con conseguente specificità alterata di PAM, le varianti Cas9 che hanno prodotto hanno mantenuto una preferenza di guanina in almeno una posizione della sequenza PAM per la modifica riportata in vivo. Concorrente rapporti hanno utilizzato evolutivo informazioni per rilassarsi ulteriormente la canonica 5\(^{\prime}\)-NNGRRT-3\(^{\prime}\) PAM specificità di Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) o per scoprire alternativa 5\(^{\prime}\)-NNNNCC-3\(^{\prime}\) PAM specificità per i canonici 5\(^{\prime}\)-NNNNGHTT-3\(^{\prime}\) PAM di Neisseria meningitidis Cas923,24., Le nucleasi di entrambi questi nuovi rapporti, tuttavia, preferiscono ancora il contenuto di GC in almeno una posizione della sequenza PAM. Abbiamo cercato di eliminare tali prerequisiti di contenuto GC tramite un flusso di lavoro personalizzato basato sulla bioinformatica che estrae la diversità PAM esistente nel genere streptococcus25. Usando questa strategia, abbiamo introdotto SmacCas9 come avente il potenziale per sopportare una specificità PAM non GC alterata allineando 115 ortologhi di SpyCas9 da UniProt (limitato a quelli con maggiore di un punteggio 70% a coppie BLOSSOM62)., Dall’allineamento abbiamo scoperto che SmacCas9 era uno dei due omologhi vicini, insieme a uno Streptococcus mutans B112SM-A Cas9 (SmutCas9), che possedeva glutammine in entrambe le posizioni allineate alle arginine a contatto con PAM altrimenti altamente conservate (Fig. 1a-b; Fig. supplementare 2 BIS). I residui di arginina sono noti per preferire fortemente le guanine nel panorama dell’interazione amminoacido-base, come evidenziato dalla specificità 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) di SpyCas9. I residui di glutammina, d’altra parte, si legano preferenzialmente alle adenine, attraverso l’interazione con il bordo della scanalatura maggiore26., Abbiamo quindi ipotizzato che SmacCas9 avesse naturalmente coevoluto le mutazioni compensative necessarie per ottenere un nuovo riconoscimento PAM ricco di adenina. Una piccola dimensione del campione di 13 distanziatori dalla matrice CRISPR del suo genoma corrispondente ci ha impedito di dedurre con sicurezza il PAM SmacCas9 in silico., Tuttavia, la possibilità per SmacCas9 richiedendo un minor contenuto di GC nella sua PAM è stato supportato da somiglianze di sequenza per il “QQR”, variante che ha 5\(^{\prime}\)-NAAG-3\(^{\prime}\) specificity27, oltre ai ricchi putativo consenso PAM per fago originari distanziali in CRISPR matrici associate altamente omologhe SmutCas9, che sono stati identificati con l’aiuto dei nostri precedentemente descritte SPAMALOT pipeline e coerente con le precedenti previsioni (Fig. 1c; Fig. supplementare 2B; Fig. supplementare 3) 25,28.

Ingegneria e caratterizzazione PAM di SpyMac

Abbiamo proceduto a determinare empiricamente le preferenze PAM di diversi ortologi streptococcici che modificano uno o entrambi i contatti PAM critici. Sulla base di esempi dimostrati di dominio di interazione PAM (PID) e RNA guida (gRNA) con compatibilità incrociata tra ortologhi Cas9 strettamente correlati e attivi, abbiamo costruito nuove varianti scambiando razionalmente la regione PI di SpyCas9 (dSpyCas9) cataliticamente “morto” con quelli degli ortologhi selezionati (Fig., 2 BIS-B) 29,30. Le varianti assemblate, tra cui dSpyMacCas9 (qui indicato come dSpyMac), sono state cotrasformate separatamente in cellule di E. coli, insieme all’RNA guida derivato da S. pyogenes e una libreria PAM 8-mer di rappresentazione uniforme della base nel circuito genetico PAM-SCANR, stabilito da Leenay et al.31. Il circuito upregulates una proteina fluorescente verde (GFP) reporter in proporzione alla forza PAM-vincolante. Pertanto, abbiamo raccolto le popolazioni cellulari GFP-positive mediante citometria a flusso (Fig., 4) e Sanger li ha sequenziati attorno al sito del PAM per determinare le preferenze di base in base alla posizione nel riconoscimento PAM di una variante corrispondente. dSpyMac, più di dSpyMutCas9, ha generato un profilo di traccia che era più coerente con il riconoscimento PAM indipendente dalla guanina, insieme a una specificità dominante per l’adenina dinucleotide (Fig. 2a; Fig. supplementare 2 QUATER).

a Cromatogrammi che rappresentano l’arricchimento basato su PAM-SCANR di sequenze PAM che riconoscono la variante da una libreria 5\(^{\prime}\)-NNNNNNNN-3\(^{\prime}\). b Gel di agarosio tinto SYBR che mostrano digestione in vitro di substrati di 10 nM 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) dopo 16 minuti di incubazione con 100 nM di assemblaggi enzimatici ribonucleoproteici purificati. Le frecce distinguono la fascia dei prodotti scissi dal substrato non rasato (fascia superiore)., I grafici a matrice riassumono i calcoli delle frazioni scisse, che sono stati eseguiti in uno script personalizzato per l’elaborazione delle immagini gel. I campioni sono stati eseguiti in duplicati biologici indipendenti (n = 2). c Misurazioni del corso temporale della scissione del substrato del DNA bersaglio per SmacCas9 e SpyMac. d La scissione del substrato del DNA tracciata in funzione dei rapporti molari 0.25:1, 1: 1 e 4: 1 della ribonucleoproteina da target per SpyCas9 wild-type e SPYMAC ibrido. I dati di origine sono forniti come file di dati di origine.,

Successivamente, abbiamo purificato gli enzimi nucleasi-attivi per continuare a sondare il potenziale di riconoscimento del bersaglio del DNA e l’unicità di SpyMac. (Supplemento Fig. 5 BIS) 27,32. Abbiamo incubato individualmente gli enzimi complessi ribonucleoproteici (composti da Cas9 + crRNA + tracrRNA ) con substrati target a doppio filamento di tutti i 5\(^{\prime}\)/3\(^{\prime}\) – combinazioni di base vicine ad un adenina dinucleotide PAM (5\(^{\prime}\)-NAAN-3 \ (^{\prime}\); Fig. 2 ter)., Una breve digestione di 16 minuti indicava sia lo SmacCas9 wild-type che lo SpyMac ibrido scisso adiacente ai motivi 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) in modo più ampio e uniforme rispetto alla variante QQR precedentemente riportata. SpyMac si è distinto ulteriormente con rapidi tassi di taglio del DNA che assomigliano alla cinetica di digest veloce di SpyCas9 (Fig. 2 quater-d) 33. Abbiamo eseguito reazioni che hanno utilizzato diverse lunghezze del distanziatore crRNA e la sequenza tracrRNA, in quanto quest’ultima differisce leggermente tra i genomi S. macacae e S. pyogenes (Fig. 5 TER-E)., Nessuno di questi due parametri ha compensato il tasso di scissione più lento di SmacCas9, ma abbiamo notato un miglioramento marginale nell’attività della forma wild-type con il suo tracrRNA nativo, che si comporta con l’interfaccia dell’interazione guida-Cas9 essendo per lo più al di fuori del dominio PI.

Modifica del genoma con iSpyMac

un’analisi di CRISPResso2 indel a seguito di NGS di regioni genomiche amplificate per valutare l’editing su target di iSpyMac rispetto a SpyMac e SpyCas9, sui 5\(^{\prime}\)-NAA-3\(^{\prime}\) e 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) Sequenze PAM. I campioni sono stati eseguiti in due repliche di trasfezione indipendenti (n = 2). b Efficienza heatmap di mismatch tolerance assay su target genomici., Le frequenze indel quantificate, come valutate dall’algoritmo TIDE 41, sono esposte per ogni singola o doppia mancata corrispondenza etichettata nella sequenza sgRNA per la variante Cas9 indicata e la sequenza PAM indicata. I campioni sono stati eseguiti in due repliche di trasfezione indipendenti (n = 2). c CRISPResso2 analisi di editing di base genomica a seguito di NGS di ampliconi genomici per valutare la conversione delle citosine in timine da iSpyMac-BE3. I campioni sono stati eseguiti in due repliche di trasfezione indipendenti (n = 2). Tutti i dati di origine sono forniti come file di dati di origine.,

Successivamente, abbiamo valutato la tolleranza di iSpyMac a sequenze non corrispondenti, impiegando sgRNAs che ospitano disallineamenti doppi o singoli a un protospacer fisso all’interno del gene AAVS, in possesso di una sequenza PAM 5\(^{\prime}\)-GAAG-3\(^{\prime}\). iSpyMac ha dimostrato capacità di editing su target con singoli disallineamenti all’interno del segmento PAM-prossimale dello sgRNA., Per mitigare questa presunta propensione off-target, abbiamo introdotto la mutazione R691A, che è stata precedentemente isolata tramite selezione batterica per SpyCas9 per mantenere un’elevata attività on-target riducendo al contempo la modifica off-target35. La nostra variante ad alta fedeltà, HiFi-iSpyMac, ha mostrato un’attività quasi trascurabile su sequenze non corrispondenti, rispetto all’enzima originale, con una minima perdita di attività sul bersaglio (Fig. 3 ter).,

Infine, abbiamo selezionato una finestra di quattro nucleotidi nel locus VEGFA in un contesto di sequenza tale che qualsiasi altra endonucleasi CRISPR con uso riportato per l’editing di base non consentirebbe il loro editing di base con un enzima fuso con citidina deaminase36. Di conseguenza, abbiamo cotrasfettato le cellule HEK293T con una forma nickase di iSpyMac derivata dall’architettura BE3 precedentemente riportata per l’editing della base della citosina (iSpyMac-BE3) e il plasmide sgRNA che mira a un PAM a valle dei nucleotidi selezionati5., Abbiamo misurato livelli di editing di base efficaci nelle cellule raccolte, che hanno mostrato oltre il 20% di conversione da citosina a timina in queste posizioni tramite l’analisi NGS (Fig. 3 quater).