Diagnosi Eziologica delle Infezioni Pneumococciche
Pneumococchi sono una delle principali cause di polmonite e un’importante causa di meningite, batteriemia, sepsi, otite media, rinite e sinusite . Classicamente, la diagnosi eziologica di queste infezioni è stata fatta facendo crescere il microrganismo da campioni di pazienti adatti.,
L’identificazione di Streptococcus pneumoniae dalla coltura dipende dall’osservazione delle caratteristiche morfologiche sia dei batteri che delle colonie, nonché da altre tre principali caratteristiche fenotipiche, tra cui la negatività della catalasi, la solubilità biliare e la suscettibilità all’optochina. La suscettibilità all’optochina è un pilastro per l’identificazione degli pneumococchi a causa della facilità di esecuzione del test, la cui base è l’inibizione dell’optochina dell’ATPasi pneumococcica, una caratteristica che non è generalmente condivisa da altri streptococchi viridiani ., Tuttavia, l’emergere di varianti resistenti all’optochina ha messo in discussione la validità dell’utilizzo di questo unico test per la presunta identificazione di pneumococchi. La specificità del test di solubilità biliare rimane elevata ed è il test singolo più accurato per l’identificazione di S. pneumoniae . Il fenotipo di solubilità biliare è dovuto all’attivazione del principale enzima autolitico (una amidasi N-acetilmuramil-l-alanina codificata dal gene lytA), che può essere ottenuto anche dal desossicolato di sodio., Alcuni isolati pneumococcici sono risultati insolubili nel desossicolato di sodio, che è stato attribuito ad alterazioni nell’autolisina principale, ma la stragrande maggioranza degli pneumococchi rimane solubile nella bile, rendendolo un test estremamente accurato per l’identificazione pneumococcica.
Ionizzazione di desorbimento laser assistita da matrice-tempo di volo la spettrometria di massa (MALDI–TOF) sta portando un cambiamento fondamentale nell’identificazione di routine dei patogeni microbici nei laboratori di microbiologia clinica ., Nonostante il successo di MALDI-TOF nel razionalizzare e fornire un’identificazione costantemente accurata, anche con organismi precedentemente problematici, il successo dei sistemi attualmente disponibili nell’identificazione di S. pneumoniae è stato scarso . Il profilo di massa dei sistemi MALDI-TOF impiegati nei laboratori di microbiologia clinica è generato principalmente da proteine ribosomiali che facilitano l’allineamento con le attuali classificazioni tassonomiche. Tuttavia, S., pneumoniae è un clade all’interno del gruppo mitis evolutivamente correlato di streptococchi, con cui può condividere molte caratteristiche, tra cui proteine ribosomiali simili . Pertanto, la distinzione di MALDI-TOF tra S. pneumoniae e i suoi parenti meno patogeni del gruppo mitis è difficile. Recentemente , è stato sostenuto che fare questa distinzione potrebbe essere possibile utilizzando un’analisi più dettagliata dei profili di massa, e questo è stato seguito da una pubblicazione che riporta il successo di un sistema disponibile in commercio nel distinguere S. pneumoniae da altre specie del gruppo mitis ., Questi sviluppi incoraggianti possono comportare una semplificazione dell’identificazione di routine di S. pneumoniae nei laboratori di microbiologia clinica.
La capacità di produrre un polisaccaride capsulare (CPS) è anche un segno distintivo degli pneumococchi. La capsula può essere visualizzata con diverse tecniche di microscopia, ma negli pneumococchi la presenza di un CPS viene solitamente rilevata utilizzando sieri specifici . Lo Statens Serum Institut di Copenhagen, Danimarca, è la fonte più frequente di sieri per identificare le capsule pneumococciche., Forniscono un “omni-siero” che reagisce con tutte le capsule pneumococciche conosciute e che può essere utile nell’identificazione di pneumococchi, così come sieri specifici che reagiscono solo con particolari polisaccaridi o gruppi di polisaccaridi . Gli pneumococchi non incapsulati sono noti e sono stati frequentemente associati a focolai di congiuntivite . Tuttavia, poiché la produzione di un CPS è un tratto così determinante degli pneumococchi, questi sono stati sottoposti a test particolarmente rigorosi per confermare la loro identificazione come S. pneumoniae .,
L’identificazione del CPS pneumococcico mediante l’effetto Quellung o il test di Neufeld, utilizzando sieri specifici di coniglio, è una tecnica collaudata che è stata utilizzata fin dai primi giorni della sierotipizzazione pneumococcica . Tuttavia, questa tecnica richiede competenze specifiche, quindi più recentemente, lo Statens Serum Institut ha reso disponibile un test di agglutinazione al lattice, che consente una procedura più snella per la sierotipizzazione degli pneumococchi . Per semplificare ulteriormente questo processo, sono stati sviluppati diversi schemi di “sierotipizzazione genetica” per identificare particolari caratteristiche dei loci cps., Nonostante la moltitudine di approcci, quelli più ampiamente adottati si basano sull’amplificazione PCR di specifici geni sierogruppo o sierotipo . In effetti, sono state sviluppate procedure di PCR sia convenzionali che in tempo reale e sono stati proposti una grande diversità di schemi per adattarsi alle differenze di prevalenza dei vari sierotipi nelle diverse regioni geografiche ., Sebbene la sierotipizzazione genetica abbia reso la sierotipizzazione disponibile a un maggior numero di laboratori e abbia contribuito a chiarire reazioni poco chiare, i metodi fenotipici rimangono il gold standard per la sierotipizzazione pneumococcica e , riflettendo questo, sono stati sviluppati anche approcci ibridi che coinvolgono sia la PCR che gli anticorpi monoclonali ., Forse gli esempi più chiari di questo sono isolati in cui il locus capsulare contiene mutazioni puntiformi o inserzioni che portano all’assenza di espressione di un CPS (van der Linden e Ramirez, dati inediti) ma a cui verrebbe assegnato un sierotipo secondo schemi di sierotipizzazione genetica.
Nuove metodologie basate sulla rilevazione di componenti microbici stanno diventando sempre più importanti nella diagnosi delle infezioni da pneumococco ., Il rilevamento immunocromatografico del polisaccaride C (acido teichoico) nelle urine ha notevolmente migliorato la diagnosi di polmonite pneumococcica negli adulti, sebbene nei bambini l’alta frequenza del trasporto pneumococcico determini una specificità inadeguata del test . La prova inoltre è convalidata per uso in CSF, piombo alla diagnosi eziologica migliorata della meningite ., Ci sono prove crescenti dell’utilità del test nel rilevare pneumococchi nel liquido pleurico sia nei bambini che negli adulti , ma ci sono molte meno informazioni riguardo al suo uso nel lavaggio broncoalveolare , negli aspirati nasofaringei o nei mezzi di coltura del sangue , dove può essere utile nel rilevare pneumococchi che non sono più vitali.
Più recentemente, la rilevazione del DNA pneumococcico è stata utilizzata per la diagnostica. A questo scopo, è stata utilizzata l’amplificazione mediante PCR di frammenti di geni specifici di S. pneumoniae, come lytA, ply, psaA, cpsA (wzg) o spn9802., Le metodologie di PCR in tempo reale hanno dimostrato di essere più sensibili rispetto alla PCR convenzionale, ma sono state sviluppate anche altre varianti, tra cui il rilevamento dei prodotti PCR con perline, microarray o frazionamento delle dimensioni . La combinazione dell’amplificazione del DNA per l’identificazione con gli approcci genetici di sierotipizzazione discussi sopra consente l’identificazione del sierotipo del ceppo senza la necessità di coltura . L’uso di queste metodologie in effusioni parapneumoniche o empiema è ben documentato e migliora notevolmente la resa diagnostica eziologica sulla coltura .,
C’è grande interesse nell’utilizzo di queste metodologie per rilevare gli pneumococchi nel sangue per i casi di polmonite sia nei bambini che negli adulti . Tuttavia, l’alto tasso di trasporto di pneumococchi nei bambini potrebbe essere un importante confondente rilevando la circolazione del DNA pneumococcico nei portatori sani . Due studi hanno affrontato specificamente questo problema, con risultati contraddittori . Altri studi indicano che il carico pneumococcico stimato nel sangue è correlato con la gravità della malattia e potrebbe potenzialmente essere usato per distinguere tra colonizzazione e infezione .,
Un approccio simile è stato sostenuto nel caso dei campioni respiratori che sono più frequentemente disponibili, come l’espettorato. Il valore dell’espettorato nella diagnosi di polmonite è stato ampiamente discusso, anche nel contesto dei metodi di coltura convenzionali. Mentre si può sostenere che l’assenza di pneumococchi potrebbe potenzialmente escluderlo come agente eziologico, un’ipotesi che certamente giustifica ulteriori studi, la sua individuazione potrebbe essere attribuita all’infezione o al trasporto asintomatico ., Negli adulti, la quantificazione di pneumococchi o DNA pneumococcico nell’espettorato è stata proposta per distinguere tra colonizzazione e malattia , ma ciò può essere complicato dalla variabilità dei saggi e dalla mancanza di criteri chiari per definire i valori di cutoff, anche in campioni di buona qualità . Nei bambini sono stati suggeriti approcci simili, ma il valore diagnostico di questo approccio è ulteriormente messo in discussione dal fatto che molti bambini sono colonizzati da pneumococchi a densità molto elevate., Il monitoraggio di due marcatori chiave dell’ospite, la proteina C-reattiva e la procalcitonina, sembra aumentare la specificità dei test PCR nella diagnosi di infezione del tratto respiratorio inferiore da pneumococco . Nonostante queste incertezze, diversi test disponibili in commercio offrono già la rilevazione del DNA pneumococcico a scopo diagnostico .,
Sebbene i metodi microbiologici tradizionali, compresi i più recenti metodi di rilevamento dell’antigene, rimarranno il pilastro in molti laboratori per la diagnosi delle infezioni da pneumococco, i nuovi metodi molecolari diventeranno indubbiamente sempre più importanti. La maggiore adozione di test molecolari dipenderà dal chiarire l’importanza per l’identificazione dell’infezione di rilevare prove della presenza di prodotti batterici nei campioni umani. Questo sarà particolarmente complicato per i campioni respiratori, dove il dibattito rimane in corso, anche per gli approcci più tradizionali., Data la nostra crescente comprensione delle relazioni tra più agenti patogeni nel tratto respiratorio superiore che possono condizionare la loro capacità di causare infezioni, gli approcci molecolari che rilevano più agenti patogeni diventeranno indubbiamente sempre più importanti nella diagnosi eziologica delle infezioni del tratto respiratorio .