PESCE Test oncologici

il Cancro si riferisce ad un complesso ed eterogeneo gruppo di malattie caratterizzate dall’incontrollata e disordinata proliferazione di cellule, che spesso acquisiscono la capacità di invadere altri tessuti. Il cancro di solito ha origine nelle cellule somatiche che, come conseguenza di una serie di mutazioni genetiche, eludono i meccanismi che regolano l’omeostasi tissutale, come l’inibizione del contatto cellula-cellula, i segnali di differenziazione e l’induzione della morte cellulare., Le mutazioni responsabili della trasformazione tumorale riguardano due gruppi principali di geni, noti come proto-oncogeni (stimolatori del ciclo cellulare) e soppressori tumorali (repressori della progressione del ciclo cellulare). Queste alterazioni funzionali possono verificarsi come conseguenza di mutazioni a singolo nucleotide, ma possono anche essere causate da modifiche più grandi nel materiale genetico, come inserimenti, delezioni, duplicazioni o traslocazioni di un frammento cromosomico. Queste anomalie nelle cellule tumorali possono essere utilizzate come biomarcatori tumorali., La quantificazione dei cambiamenti nel numero di copie del gene o nella ri-sistemazione del gene è fondamentale per la nostra comprensione della biologia del tumore, da qui l’importanza dei test genetici basati sul profiling della citogenetica molecolare.

Che cos’è il PESCE ?

L’ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) è una tecnica citogenetica utilizzata per il rilevamento e la localizzazione di sequenze nucleotidiche (DNA o RNA) all’interno di tessuti o cellule., Il PESCE può essere utilizzato per “mappare” il materiale genetico nelle cellule umane, fornendo informazioni sulla posizione, la lunghezza e il numero di copie di geni specifici o porzioni cromosomiche. Richiede la sintesi di una sonda fluorescente-contrassegnata, che è una sequenza dell’acido nucleico legata ad una molecola fluorescente del reporter, che poi legherà (ibriderà) ad una sequenza specifica dell’obiettivo. Le sonde FISH possono essere etichettate con vari metodi (ad esempio nick translation, random priming), a partire da diversi input di acidi nucleici, come DNA/RNA genomico, cromosomi artificiali batterici (BACs) o cosmidi.,
Il primo passo nel processo FISH è immobilizzare metafase cromosomiche si diffonde o cellule interfase contenenti il DNA bersaglio su un vetrino. Successivamente, sia il campione di DNA che la sonda di PESCE sono denaturati dal calore. Quando la sonda è in contatto con il materiale genetico bersaglio, si legherà specificamente alla sua sequenza complementare sul cromosoma. Gli ibridi formati tra le sonde e i loro bersagli di sequenza possono quindi essere visualizzati utilizzando un microscopio fluorescente (Figura 1)., In generale, si possono distinguere due tipi di sonde FISH: le sonde di enumerazione cromosomica (CEPs o CENs) che mirano alle regioni pericentromeriche del cromosoma e utilizzate per enumerare i cromosomi; e gli indicatori locus-specific (LSI) che riconoscono specificamente i geni di interesse.

Il PESCE presenta diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche citogenetiche classiche, come il cariotipo G-banding. Innanzitutto, ha una risoluzione più alta (20-150kb vs 5Mb). Inoltre, il PESCE può essere applicato sia ai cromosomi metafase che interfase, il che significa che le cellule non devono essere coltivate per diversi giorni prima che i cromosomi possano essere preparati per l’analisi., Ciò implica anche che FISH è adatto per l’analisi di diversi tipi di tipi di campioni, tra cui tumori solidi e tessuti incorporati in paraffina (FFPE) fissati alla formalina. Inoltre, le sonde FISH possono essere etichettate con diversi fluorofori, consentendo il monitoraggio simultaneo di più siti.

Aberrazioni cromosomiche nel cancro

Grazie alla sua versatilità, FISH può essere utilizzato per l’analisi citogenetica sia di tumori solidi (es. tumore della mammella, tumore del polmone non a piccole cellule, tumore del colon-retto) che ematologici o tumorali del sangue (es. leucemia, linfomi, mieloma multiplo)., La rilevazione di anomalie genetiche è utile non solo per il cancro, ma anche come strumento per analizzare la predisposizione genetica e le informazioni specifiche della malattia e per prevedere un risultato chemioterapico.

PESCE per il cancro ai polmoni

Il cancro ai polmoni è la più comunemente diagnosticata e la principale causa di decessi correlati al cancro. In particolare, il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) rappresenta ~80-85% di tutti i tumori polmonari. Mutazioni somatiche sui geni EGFR e ALK sono spesso associate a NSCLC., EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) è una classe di recettori della tirosina chinasi la cui attività è deregolamentata in diversi tipi di neoplasie epiteliali (incluso il cancro del polmone), in quanto svolgono un ruolo importante nella proliferazione delle cellule tumorali, nell’angiogenesi e nelle metastasi. Per questo motivo, diverse strategie per interferire con la funzione EGFR sono comunemente sfruttate per la terapia dei pazienti. Gli inibitori dell’attività della tirosina chinasi di questi recettori (ad esempio erlotinib, gefitinib) sono ampiamente utilizzati nei trattamenti clinici NSCLC., Sfortunatamente, a causa della varietà di mutazioni genetiche alla base della disfunzione EGFR, alcuni pazienti sono insensibili a questo tipo di trattamento. Diversi gruppi di pazienti possono infatti essere distinti in base al tipo di alterazione effettuata dall’EGFR, come l’amplificazione genica, la delezione o le sostituzioni a singolo nucleotide, che possono alterare la sua attività in modi diversi (cioè non attraverso il dominio della tirosina chinasi). Di conseguenza, il numero di copia EGFR determinato da FISH è uno dei biomarcatori utilizzati per selezionare la terapia corretta.,

Il PESCE è comunemente usato per rilevare inversioni o traslocazioni nel gene ALK. Il gene ALK si trova sul braccio corto del cromosoma 2 (2p23) e codifica per il recettore della tirosina chinasi transmembrana. ALK non deve essere espresso nel polmone adulto. Tuttavia, in condizioni patologiche, il gene ALK si rompe e fonde il suo 3’ (contenente il dominio della tirosina chinasi) con il 5 ‘ di altri geni. Questo evento può portare all’attivazione incontrollata di vie di segnalazione a valle di ALK. La fusione più comune si verifica con EML4, a causa di un’inversione sul braccio corto del cromosoma 2.,
FISH è il metodo approvato dalla FDA per rilevare inversioni o traslocazioni nel gene ALK. Tipicamente, le sonde che mirano alla regione 3’ e 5 ‘ del gene sono etichettate con fluorofori diversi: nei nuclei negativi, i colori appariranno vicini l’uno all’altro (spesso sovrapposti), mentre nelle cellule tumorali i segnali si separeranno a causa del riarrangiamento cromosomico (Figura 4).

Una terza sonda mirata al potenziale partner ALK potrebbe ulteriormente confermare e definire il riarrangiamento cromosomico che si verifica in un paziente (Figura 4C)., I tumori polmonari che ospitano mutazioni che portano all’iperattivazione dell’ALK possono essere trattati con inibitori dell’ALK come Crizotinib.

PESCE per il cancro al seno

Questa è la neoplasia maligna più comune nelle donne e la seconda causa di morte correlata al cancro in tutto il mondo. Il cancro al seno è caratterizzato spesso dalle anomalie nello stato del ricevitore, piombo ad un upregulation delle vie cellulari di trasduzione responsabili della proliferazione e della sopravvivenza delle cellule. In particolare, circa il 20-30% dei tumori del cancro al seno è noto per sovraesprimere HER2/Neu, un membro della famiglia EGFR., Un trattamento comune in questi casi è Trastuzumab, un anticorpo monoclonale umanizzato approvato dalla FDA nel 1998 per il trattamento del cancro al seno. Il suo meccanismo molecolare esatto rimane da chiarire, ma questo anticorpo probabilmente impedisce l’attivazione di HER2 legandosi al suo dominio extracellulare. Inoltre, sembra indurre la lisi delle cellule tumorali stimolando la citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC). FISH, utilizzando una sonda appropriata contro HER2, può essere utilizzato per identificare copie extra del gene, segno che è più probabile che risponda al trattamento con Trastuzumab.,

PESCE per il cancro alla vescica

È il quinto tumore maligno umano più comune e il secondo tumore genito-urinario più frequentemente diagnosticato dopo il cancro alla prostata., È una malattia poligenica, il che significa che è stata associata a più anomalie genetiche, come mutazioni nei geni FGFR3, RB1, HRAS, TP53 o TSC1. Tuttavia, l’evento di iniziazione è probabilmente una mutazione nella regione 9p21, contenente il gene p16 / CDKN2A. Inoltre, le cellule tumorali della vescica sono caratterizzate da un elevato grado di instabilità cromosomica (CIN). La duplicazione o segregazione cromosomica disfunzionale durante la mitosi causa riarrangiamenti e traslocazioni del DNA, guadagno o perdita di cromosomi interi (aneuploidia) o frammenti cromosomici., Lo squilibrio risultante del materiale genetico peggiora dopo ogni ciclo cellulare. I conseguenti pattern genomici possono essere correlati ai diversi stadi di sviluppo tumorale, con le forme più invasive che mostrano il maggior numero di alterazioni citogenetiche.
Le alterazioni cromosomiche numeriche e strutturali presenti nelle cellule tumorali della vescica possono essere utilizzate come marcatori tumorali.
In particolare, il rilevamento simultaneo della variazione del numero di copie dei cromosomi 3, 7 e 17 e la cancellazione della regione 9p21 (contenente p16) da parte di FISH utilizzando quattro sonde distinte è una pratica comune., Questo metodo è utile per fornire informazioni sulla progressione e la ricorrenza del cancro.

PESCE per Leucemia Linfocitica cronica (CLL)

L’analisi delle neoplasie ematologiche è uno degli esempi tipici dei vantaggi del PESCE per l’analisi di campioni caratterizzati da un cariotipo variabile e da una bassa attività mitotica. La CLL è la leucemia più comune negli adulti. Non è stato associato ad una specifica alterazione genetica ricorrente., Invece, simile al cancro della vescica, un pannello di diverse mutazioni è stato associato a diverse gravità della malattia e sono usati come indicatori predittivi del decorso clinico del paziente. I pannelli FISH, in questo caso, includono spesso sonde per rilevare la trisomia 12 e le eliminazioni 11q, 13q e 17p., Delezione 11q, che nella maggior parte dei casi riguarda il gene ATM, è stato trovato in pazienti che mostrano una rapida progressione del cancro; trisomia 12 è associato a stadi avanzati della malattia, la resistenza alla chemioterapia e più brevi i tempi di sopravvivenza; delezione 13q è più comunemente trovato ed è in genere associato con un più favorevole la prognosi; delezione 17p spesso include una delezione del gene TP53 e corrisponde ad una fase avanzata del tumore, con un povero tasso di sopravvivenza.
Enzo Life Sciences è leader globale nelle tecnologie di etichettatura del DNA e dell’RNA., Offriamo una gamma di prodotti per le vostre esigenze di genomica e ricerca sul cancro. Per un metodo semplice ed efficiente per la generazione di DNA etichettato, si prega di consultare il nostro Nick traduzione DNA labeling kit così come un elenco dei nostri SEEBRIGHT ® fluorescente dye-dUTPs e il nostro Allylamine-dUTP. Non sei sicuro se usare biotina o digoxigenina per l’etichettatura della sonda ISH? Possiamo aiutarvi lì! Non dimenticare di controllare il visore spectra di Enzo per i profili di lunghezza d’onda di eccitazione ed emissione di coloranti comuni e gli altri nostri test basati su cellule di fluorescenza., Mentre ci sei, si prega di controllare il nostro TechNote sui pro ei contro di pesce, aCGH, e NGS e Come utilizzare allylamine-dUTP per FISH DNA probe etichettatura. Per tutte le domande e le preoccupazioni riguardanti uno qualsiasi dei nostri prodotti, il nostro team di supporto tecnico è qui per assistervi.