Questo materiale è accompagnato da una presentazione sulla struttura delle proteine e sui principi alla base della denaturazione dei campioni e dell’elettroforesi su gel discontinua.
La separazione delle macromolecole in un campo elettrico è chiamata elettroforesi. Un metodo molto comune per separare le proteine mediante elettroforesi utilizza un gel di poliacrilammide discontinuo come mezzo di supporto e sodio dodecil solfato (SDS) per denaturare le proteine. Il metodo è chiamato elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE)., Il sistema più comunemente usato è anche chiamato il metodo Laemmli dopo U. K. Laemmli, che è stato il primo a pubblicare un documento che impiega SDS-PAGE in uno studio scientifico.
SDS (chiamato anche lauril solfato) è un detergente anionico, il che significa che quando disciolto le sue molecole hanno una carica negativa netta all’interno di un ampio intervallo di pH. Una catena polipeptidica lega quantità di SDS in proporzione alla sua massa molecolare relativa. Le cariche negative su SDS distruggono la maggior parte della struttura complessa delle proteine e sono fortemente attratte verso un anodo (elettrodo caricato positivamente) in un campo elettrico.,
I gel di poliacrilammide trattengono le molecole più grandi dalla migrazione veloce come le molecole più piccole. Poiché il rapporto carica-massa è quasi lo stesso tra i polipeptidi denaturati con SDS, la separazione finale delle proteine dipende quasi interamente dalle differenze nella massa molecolare relativa dei polipeptidi. In un gel di densità uniforme la distanza di migrazione relativa di una proteina (Rf, la f come pedice) è negativamente proporzionale al log della sua massa., Se le proteine di massa nota vengono eseguite simultaneamente con le incognite, è possibile tracciare la relazione tra Rf e massa e stimare le masse di proteine sconosciute.
La separazione proteica mediante SDS-PAGE può essere utilizzata per stimare la massa molecolare relativa, per determinare l’abbondanza relativa delle principali proteine in un campione e per determinare la distribuzione delle proteine tra le frazioni. È possibile valutare la purezza dei campioni proteici e seguire il progresso di una procedura di frazionamento o purificazione., Diversi metodi di colorazione possono essere utilizzati per rilevare proteine rare e per imparare qualcosa sulle loro proprietà biochimiche. Tecniche specializzate come il Western blotting, l’elettroforesi bidimensionale e la mappatura dei peptidi possono essere utilizzate per rilevare prodotti genetici estremamente scarsi, per trovare somiglianze tra loro e per rilevare e separare gli isoenzimi delle proteine.
Massa molecolare contro peso molecolare
La massa molecolare (simbolo m) è espressa in Dalton (Da). Un Dalton è definito come 1/12 la massa di carbonio 12., La maggior parte delle macromolecole sono abbastanza grandi da utilizzare il kiloDalton (kDa) per descrivere la massa molecolare. Il peso molecolare non è lo stesso della massa molecolare. È anche noto come massa molecolare relativa (simbolo Mr, dove r è un pedice). Il peso molecolare è definito come il rapporto tra la massa di una macromolecola e 1/12 la massa di un atomo di carbonio 12. È una quantità adimensionale.
Quando la letteratura dà una massa in Da o kDa si riferisce alla massa molecolare. Non è corretto esprimere il peso molecolare (massa molecolare relativa) in Dalton., Tuttavia troverete il peso molecolare termine utilizzato con Dalton o kiloDaltons in qualche letteratura, spesso utilizzando l’abbreviazione MW per peso molecolare.
Gel di poliacrilammide per SDS-PAGE
Sono stati sviluppati molti sistemi per l’elettroforesi proteica e gli apparecchi utilizzati per SDS-PAGE variano ampiamente. La metodologia utilizzata in queste pagine utilizza il metodo Laemmli. Il riferimento al metodo Laemmli in una sezione materiali e metodi elimina la necessità di descrivere i buffer, la fusione di gel, l’apparato, ecc., A meno che la carta impiega qualche modifica al metodo, gli unici dettagli di SDS-PAGE che dovrebbero essere riportati in una sezione metodi sono percentuale totale acrilammide (%T) in un gel, percentuale relativa e tipo di reticolato (%C), e forse un riferimento alle dimensioni del gel. Utilizziamo un sistema “mini-gel”, con 3 cassette gel da 1/4 “x 4”.
SDS-PAGE può essere condotta su gel pre-cast, risparmiando il problema e il rischio di lavorare con acrilammide. La seguente descrizione si applica agli apparecchi di colata e di funzionamento fabbricati in negozio che sono molto più economici delle apparecchiature disponibili in commercio., Oltre all’efficacia dei costi, un vantaggio di creare i propri gel la prima volta è una comprensione più profonda del processo.
Indipendentemente dal sistema, la preparazione richiede la fusione di due diversi strati di acrilammide tra lastre di vetro. Lo strato inferiore (separando o risolvendo il gel) è responsabile della separazione effettiva dei polipeptidi per dimensione. Lo strato superiore (gel impilabile) include i pozzetti del campione. È progettato per spazzare le proteine in un campione tra due confini mobili in modo che vengano compresse (impilate) in strati sottili micrometrici quando raggiungono il gel di separazione.,