A L’identificazione degli elementi IS in E. coli
Gli elementi IS sono stati rilevati per la prima volta dagli effetti causati se questi elementi sono integrati negli operoni lac (Malamy, 1966, 1970) e gal (Saedler e Starlinger, 1967a,b; Jordan et al., 1967; Adhya e Shapiro, 1969) di E. coli e nel primo operone verso destra del suo batteriofago lambda (Brachet et al., 1970)., Gli elementi causano una mutazione nulla del gene in cui si integrano e un effetto polare molto forte su tutti i geni dell’operone situati distalmente al gene mutato. Le mutazioni ritornano spontaneamente al tipo selvaggio, ma la frequenza di reversione non potrebbe essere migliorata dai mutageni. Ciò ha sollevato il sospetto che le mutazioni non fossero mutazioni puntiformi, ma riarrangiamenti del DNA.,
Si potrebbe dimostrare che la mutazione ha aggiunto il DNA all’operone gal confrontando la densità del batteriofago di trasduzione lambda dgal che ha o non ha portato la mutazione ed era altrimenti isogenico (Jordan et al., 1968; Shapiro, 1969). Ciò ha escluso la possibilità che le mutazioni siano state causate da un’inversione del DNA. Per distinguere tra le due possibilità rimanenti, la duplicazione di parte dell’operone gal o l’inserimento in questo operone di DNA non correlato, Michaelis et al., (1969) ha confrontato il DNA mutato e il DNA non mutato ibridando l’RNA trascritto dal mutante a uno dei due DNA. Questi esperimenti hanno mostrato chiaramente che il DNA extra trovato nei mutanti non era derivato dall’operone gal. Inoltre, si potrebbe dimostrare che il DNA extra in due mutanti indipendenti condivideva almeno alcune di queste sequenze. Ciò ha sollevato la possibilità che i mutanti non siano stati causati dall’inserimento di segmenti casuali di DNA di E. coli, ma piuttosto dalla trasposizione di specifici elementi trasponibili.,
Questa ipotesi è stata dimostrata vera, quando un numero maggiore di mutanti è stato studiato inserendo molecole di DNA eteroduplex nel microscopio elettronico (Fiandt et al., 1972; Hirsch et al., 1972a, b; Malamy et al., 1972). Quattro diversi elementi potrebbero essere identificati in quel momento. Sono state chiamate sequenze di inserimento (IS) e numerate consecutivamente da IS1 a IS4. IS1 è lungo circa 0,8 Kb (kilobase). L’altro È elementi hanno una lunghezza di circa 1,5 Kb. Un quinto elemento, IS5, di dimensioni simili (Blattner et al.,, 1974) e un elemento più grande di poco più di 5 Kb, che per ragioni storiche è chiamato γ-δ(Guyer, 1978), sono stati rilevati da allora, ma il numero sembra essere vicino alla saturazione per E. coli K12.
All’interno della limitazione del microscopio elettronico, i diversi elementi IS non condividono sequenze, mentre diversi isolati dello stesso elemento sono identici. Naturalmente, questo non esclude piccole differenze di sequenza tra questi ultimi.,
L’ibridazione di singoli filamenti di DNA appropriati che condividono solo l’elemento IS in forma complementare, seguita dalla digestione con nucleasi specifiche a singolo filamento consente l’isolamento del DNA IS in forma pura (Ohtsubo e Ohtsubo, 1976; Schmidt et al., 1976). Il rapido sviluppo dell’analisi della restrizione del DNA e dei metodi di sequenziamento hanno, infatti, permesso la determinazione della sequenza completa di IS1 (Ohtsubo e Ohtsubo, 1978; Johnsrud, 1979) e IS2 (Ghosal et al., 1979a). La sequenza di IS4 è vicina al completamento al momento della stesura di questo capitolo (R. Klaer et al., esperimenti inediti).,
Tecniche di ibridazione DNA–DNA sono state impiegate per cercare la presenza di elementi IS nel cromosoma di E. coli. IS1 e IS2 sono presenti rispettivamente in copie da 8 8 e He 5 (Saedler e Heiss, 1973). L’uso della tecnica di blotting di Southern ha permesso la determinazione esatta del numero di copia di IS3 in E. coli K12 e di IS4 . Inoltre, alcuni degli elementi IS hanno dimostrato di essere trasportati sul plasmide di fertilità di E. coli F (Davison et al., 1975a), e su alcuni fattori R (Hu et al., 1975).,
Gli elementi IS non sono noti per codificare geni che vengono tradotti in proteine, sebbene nel caso di IS1 la sequenza di DNA nota non escluda la possibilità della traduzione in un (pochi) peptide (s) di dimensioni limitate. La lunghezza degli elementi IS preclude la formazione di grandi proteine. Gli effetti noti degli elementi IS sono quindi limitati alla posizione, dove sono integrati, e alle sequenze di DNA adiacenti in posizione cis. Questi effetti sono descritti nelle sezioni seguenti.
Un’altra classe di elementi del DNA trasponibili è stata descritta dal 1974., Sono chiamati trasposoni. Di norma, sono più grandi degli elementi IS e vengono rilevati da effetti causati da proteine codificate nel DNA trasposone. I primi trasposoni descritti codificano la resistenza agli antibiotici, e la maggior parte dei trasposoni noti portano geni di resistenza (Datta et al., 1971; Hedges and Jacob, 1974; per le recensioni, vedi Cohen, 1976; Kleckner, 1977). Esistono, tuttavia, trasposoni che codificano un’enterotossina di E. coli (So et al., 1979), o geni per la fermentazione del lattosio (Cornells et al., 1979)., Tn3, oltre a trasportare un gene per la β lattamasi, trasporta anche geni coinvolti nel processo di trasposizione (Heffron et al., 1977; Gill et al., 1978; Chou et al., 1979). Lo stesso sembra essere vero per Tn5 (Berg et al., 1978).
I trasposoni si trovano in natura come parti dei plasmidi. La trasposizione tra plasmidi spiega la variabilità riscontrata per quanto riguarda la resistenza ai farmaci multipli di diversi plasmidi. In laboratorio è stata rilevata la trasposizione al genoma del batteriofago e la trasposizione al cromosoma batterico., Nessuno dei trasposoni noti, tuttavia, è un costituente naturale del cromosoma K12 di E. coli.
La letteratura sui trasposoni si sta espandendo rapidamente, e per una descrizione dei molti trasposoni diversi noti al momento della stesura di questo articolo, il lettore si riferisce a recensioni più complete di questo argomento.
Tutti i trasposoni studiati finora hanno una struttura comune: portano una sequenza di DNA ripetuta ai loro termini e geni di codifica del DNA unici tra queste sequenze di DNA ripetute. Nella maggior parte dei casi, le sequenze di DNA ripetute sono invertite l’una rispetto all’altra., La loro dimensione è variabile. In alcuni trasposoni le ripetizioni invertite sono circa 1,5 Kb, e c’è motivo di sospettare che queste sequenze siano trasponibili indipendentemente dagli elementi IS. In altri casi, il DNA ripetuto è solo di circa 0,15 Kb (ad esempio, Tn1–3, codifica della resistenza all’ampicillina (Heffron et al., 1975; Kopecko e Cohen, 1975).
Nel caso di Tn9, codifica resistenza al cloramfenicolo (McHattie e Jackowski, 1977), e Tn1681, codifica E. coli enterotossina (So et al., 1979), la sequenza ripetuta a termini è IS1., In quest’ultimo caso, le due copie di IS1 sono invertite relativamente l’una all’altra, mentre nel primo caso le due copie di IS1 sono ripetizioni dirette. Come è noto dalla sequenza di DNA di IS1 che questo elemento stesso è terminato da piccole ripetizioni di DNA non corrispondenti, la regola generale che i termini stessi dei trasposoni sono ripetizioni invertite è conservata anche per Tn9. Infatti, nel caso di IS2 (Ghosal et al., 1979a) e IS4 (Habermann et al., 1979), le ripetizioni invertite si trovano ai loro termini., La generalità di questa osservazione può persino implicare un ruolo di queste ripetizioni invertite nel processo di trasposizione.