la Verifica Sperimentale di Modelli
Il primo approccio (3) identificato il primario siti di iniziazione in 14 proteine, tra cui bovini pancreas Rnasi A e il capodoglio mioglobina, e anche altri meno stabili siti di iniziazione (11) in Rnasi A. Il primario sito di iniziazione per Rnasi A è stato identificato in questo modello, come residui di 106-118. L’applicazione del secondo approccio (8) alla RNase A (13) ha portato a sei siti (illustrati in Fig., 3 a), che erano coerenti con quelli identificati (11) dal primo approccio (3). Questi sono residui di 4-11 (regione), residui 25-34 (regione B), residui 51-57 (regione C), e antiparallelo strutture (non necessariamente a pieghe fogli) formato dall’associazione di residui 53-67 con residui 69-79 (regione D), residui 71-90 con residui 91-111 (area E), e residui di 103-111 con residui 115-124 (regione F). I passaggi successivi lungo il percorso di piegatura consistono nella crescita o coalescenza di queste regioni. La regione G si forma quando i residui 36-48 si piegano contro l’elica B., Regione G, tuttavia, contiene più ampia di contatti che non helix B. Pertanto, G è considerata in una fase successiva rispetto a B. Regione L è costituito da associazione di regione A con B, G e C. strutturale seguito della sequenza regione H, formano quando le regioni C e D vengono in contatto; da regione a regione K contenente i contatti tra le regioni e e F; da regione a regione J in aree C e D del modulo di contatti con le regioni e e F; e da regione a regione contenente I contatti di regioni e e H con G. Infine, la regione M è formata quando la regione entra in contatto con e e F.,
Il predetto primaria pieghevole sito di iniziazione della Rnasi a, in accordo con quanto osservato girare a residui 113 e 114, della molecola nativa, con l’elevato grado di conservazione dei residui apolari nel sito 106-118 di 23 specie di mammiferi di questa proteina (3), e con le informazioni sperimentali su intermedi rilevati nel termica dispiegarsi di Rnasi A (14)., NMR evidenza per la struttura locale in spiegato RNasi A in condizioni di piegatura (15) e in frammenti di esso (16), e studi immunochimici sulla formazione di siti antigenici stabili (sulla superficie della proteina, che copre il sito di iniziazione idrofobo primario sepolto quando ridotta RNasi A è ossidato (ref. 17 e figura 8 del ref. 18), erano anche coerenti con questa immagine. Altre prove sperimentali a sostegno dell’esistenza di siti di iniziazione A-F sono fornite nel rif. 11.,
Per l’apomioglobina, il primo approccio (3) ha identificato il sito di inizio della piegatura primaria come residui 103-115, che comprende la maggior parte dell’elica G, con la sequenza Tyr-Leu-Glu-Phe -le-Ser-Glu-Ala -le -le-His-Val-Leu., L’applicazione del secondo approccio (8) e i calcoli dell’energia conformazionale hanno portato al suggerimento che le interazioni tra le eliche A, G e H dell’apomioglobina potrebbero essere importanti per l’inizio della piegatura (19), in linea con i risultati sperimentali che hanno implicato queste regioni negli intermedi di equilibrio dell’apomioglobina (20) e nei primi passi cinetici della via di piegatura (21). Recenti studi sperimentali sui mutanti della mioglobina (22, 23) forniscono un supporto convincente per i modelli che incorporano l’iniziazione idrofobica e la propagazione del folding.,
L’apomioglobina è diventata un paradigma per la ricerca sui percorsi di piegatura (24). Parte della molecola di apomioglobina, costituita dalle eliche A, G e H e parte dell’elica B, si piega rapidamente per formare un intermedio on-pathway, con il resto della catena polipeptidica che si piega a una velocità più lenta, dell’ordine dei secondi (21, 25). I frammenti peptidici di apomioglobina corrispondenti alle eliche G e H hanno mostrato una propensione alla struttura elicoidale (26-28), mentre i peptidi corrispondenti al resto della proteina hanno mostrato una propensione molto inferiore alla formazione dell’elica (29)., Eppure un esperimento in cui l’elica H della mioglobina è stata mutata per diminuire la sua propensione elicoidale (30) ha mostrato pochissima influenza sul tasso di piegatura della proteina. Un effetto molto maggiore è stato osservato quando l’istidina distale (H64) è stata cambiata in fenilalanina: la sostituzione di una catena laterale non polare per l’istidina polare sepolta ha comportato un aumento significativo del tasso di piegatura (31). Questi studi hanno indicato l’importanza dell’imballaggio a catena laterale, in particolare nelle superfici di contatto delle eliche, per il tasso di piegatura dell’apomioglobina.,
L’apomioglobina ha il vantaggio di poter essere studiata all’equilibrio in una serie di condizioni di soluzione che approssimano alcuni degli stadi osservabili sulla via di piegatura cinetica. Così, è stato possibile definire le propensioni conformazionali di apomyoglobin spiegato e parzialmente piegato da NMR (32-35). È interessante notare che l’apomioglobina dispiegata con acido mostra una propensione per la struttura elicoidale non nativa in una regione che collega le eliche D ed E, così come la struttura nativa osservata nelle eliche A e H, che era stata prevista negli studi cinetici (34)., Gli studi NMR delle propensioni conformazionali delle varie forme di apomioglobina (32-35) includevano la determinazione dei parametri di rilassamento della catena polipeptidica per determinare in modo specifico la dinamica della spina dorsale in ciascuno degli stati della proteina. Invece dell’analisi” senza modello ” adatta alle proteine piegate, i dati di rilassamento sono stati analizzati calcolando le funzioni di densità spettrale ridotta J(0), J(wN) e J(wH) (36). La funzione J (0) informa sui moti della scala temporale µs-ms e suggerisce che, per l’apomioglobina a pH 2.,3, le eliche A e G stavano facendo contatti transitori (34). Questo entusiasmante risultato, successivamente convalidato da studi NMR spin-label (37), ha fornito prove definitive di contatti a lungo raggio simili a nativi in una proteina dispiegata. Ancora più intrigante, la funzione J(wN), che informa sul movimento della scala temporale ps–ns, ha mostrato una variazione dipendente dalla sequenza, che potrebbe essere correlata alla variazione di un parametro calcolato, l ‘ “area media sepolta al momento della piegatura” (AABUF) (10)., Questo parametro, che incorpora sia la dimensione dei residui che l’idrofobicità, è definito per i singoli amminoacidi, ma di solito è calcolato in media su una finestra di cinque-nove residui nella sequenza e fornisce una stima quantitativa alternativa dell’idrofobicità definita da Matheson e Scheraga (3) in termini di energia libera di formazione. Nel caso di apomioglobina a pH 2.3, picchi nella trama di J (wN) vs., il numero di residui, che indica la restrizione del movimento su scala temporale sub-ns, corrispondeva molto bene con i picchi nel diagramma AABUF, che indicano un numero superiore alla media di aminoacidi grandi e/o non polari. Questa osservazione ha suggerito che esiste un modello nella sequenza aminoacidica, definito da raggruppamenti di catene laterali grandi e/o non polari, come nel modello di ref. 3, che conduce alla restrizione del moto della spina dorsale del polipeptide causata dalla formazione idrofobica locale del mazzo.
Apomioglobina a pH 2.,3 mantiene una piccola propensione per la struttura elicoidale nelle eliche A e H, come giudicato dagli spostamenti chimici NMR osservati (34). Queste propensioni sono abolite in presenza di urea 8 M (35), tuttavia la dipendenza sequenziale dei tassi di rilassamento dell’apomioglobina denaturata dall’urea mostra anche una correlazione intrigante con il parametro AABUF. In questo caso, la correlazione è tra minimi in J (wH) e massimi di AABUF, suggerendo che le interazioni idrofobiche locali che limitano il movimento della spina dorsale su scale temporali sub-ns sono persistenti anche in urea 8 M.,
Per testare l’ipotesi che il parametro AABUF, cioè l’idrofobicità, possa essere usato per predire i siti di inizio del ripiegamento nella catena polipeptidica, è stato fatto un insieme specifico di mutazioni dell’apomioglobina (23). L’elica A, che partecipa all’intermedio cinetico che si forma per la prima volta al ripiegamento dell’apomioglobina WT, ha una sequenza che dà luogo a un massimo nel parametro AABUF, mentre l’elica E, che è in realtà altamente idrofobica secondo le scale di idrofobicità convenzionali, ha un AABUF piuttosto basso per tutta la sua lunghezza., Nell’apomioglobina piegata, la catena laterale di Trp-14, nell’elica A, si trova di fronte alla spina dorsale dell’elica E a Gly-73. È stata preparata una mioglobina a doppio mutante, in cui Trp-14 è stato sostituito con Gly e Gly-73 è stato sostituito con Trp. È stato motivato che la struttura piegata della proteina dovrebbe essere minimamente perturbata da questo scambio, ma che il parametro AABUF per le eliche A ed E dovrebbe essere drasticamente influenzato. La domanda era se anche il percorso di piegatura sarebbe stato influenzato. Infatti, folding del mutante in cui G73 e W14 sono scambiati avviene da un percorso diverso rispetto alla proteina WT., Tutte le varianti di apomyoglobin che finora sono state studiate piegano via un intermedio di fase di scoppio che contiene la struttura elicoidale. Nel caso dell’apomioglobina WT, questo intermedio contiene le eliche A, G e H (e anche parte dell’elica B). Nel mutante di scambio G73–W14, l’intermedio contiene le eliche E, G e H; l’elica A non è protetta nella fase iniziale di piegatura, ma si piega in seguito. Questo risultato (illustrato in Fig. 4) è stato confermato da studi spin-label che mostrano contatti tra le eliche E, G e H nel mutante, piuttosto che i contatti A, G e H osservati nella proteina WT.,