Frontiers in Veterinary Science (Italiano)

Introduzione

Gli invertebrati comprendono circa un milione di specie animali allevati sia in istituti zoologici che in famiglie dove vengono allevati a mano come animali esotici (1). I gasteropodi comprendono quasi 60.000 specie di molluschi acquatici e terrestri, principalmente lumache e lumache (1). La lumaca gigante terra africana (Achatina fulica, syn., Lissachatina fulica) è originaria dell’Africa orientale, tuttavia è una specie invasiva diffusa in Asia, Oceania e più recentemente nelle Americhe, dove è stata introdotta accidentalmente o intenzionalmente come fonte di cibo e come animale domestico. Il suo rilascio negli ecosistemi naturali, nelle aree agricole e urbane ha provocato minacce ecologiche, sanitarie e agricole (2, 3). La lumaca terrestre africana gigante è un ospite intermedio per diversi parassiti tra cui Aelurostrongylus abstrusus, Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus costaricensis, Schistosoma mansoni, Hymenolepis spp.,, e Fasciola hepatica (4, 5). Tutti gli elminti di cui sopra, ad eccezione di A. abstrusus, sono in grado di causare gravi malattie negli esseri umani. In particolare, la lumaca gigante africana è il principale gasteropode responsabile della diffusione mondiale di A. cantonensis che causa la meningoencefalite eosinofila umana in Asia e nelle Americhe (2, 6). I fattori di rischio per l’infezione nell’uomo, negli animali domestici e nella fauna selvatica con quei parassiti elminti includono l’ingestione di lumache o lumache infette crude o poco cotte o alimenti contaminati dalla melma di lumache o lumache infette (4, 5, 7, 8).,

Anche se le lumache terrestri giganti africane sono tra le lumache più popolari tenute come animali domestici, e la loro popolarità mondiale come animali esotici sta crescendo rapidamente, solo pochi sondaggi sono stati effettuati sulla presenza dei loro parassiti in condizioni naturali (2, 6, 9-11). Lo scopo di questa indagine era quello di indagare l’insorgenza di parassiti nelle lumache terrestri africane giganti allevate come animali domestici nel sud Italia.,

Materiali e metodi

Dati generali

Nell’agosto 2018, tre pool di campioni fecali freschi ottenuti da un totale di 60 lumache terrestri africane giganti, conservate in tre diverse collezioni private situate a Pozzuoli, Caserta e Napoli (Italia), sono stati studiati per i parassiti. Da ogni località abbiamo ottenuto una pozza di feci da 20 singole lumache ciascuna. Le lumache incluse in questo sondaggio avevano un’età media di 1,6 anni che andava da 0,2 a 2 anni e non avevano ricevuto alcun trattamento antiparassitario precedente., Le lumache sono state alimentate con frutta e verdura fresca; inoltre, una supplementazione di polvere di calcio (Calcio, Exo Terra, Hagen Deutschland GmbH& Co. KG, Holm, Germania) è stato fornito due volte a settimana. Tutti gli animali sono stati allevati in Italia, di proprietà privata e tenuti come animali domestici in quattro terrari interni di dimensioni 60 × 30 × 45 cm, in gruppi di 10-20 animali (2 gruppi di 20 lumache a Pozzuoli e Caserta e 2 gruppi di 10 lumache ciascuno a Napoli)., Come substrato è stato utilizzato un terreno organico di torba (Organic Coco-Peat Soil, E-Coco Products, Gloucestershire, UK), precedentemente trattato termicamente (100°C per 30 min) e quindi privo di parassiti e insetti.

Procedure diagnostiche

Venti grammi di feci fresche sono stati inizialmente ottenuti da ciascuno dei quattro terrari., Quando le feci raggruppate analizzate da striscio fresco, flottazione e test di Baermann hanno mostrato positività ai nematodi rabditidi, due lumache di ciascun terrario positivo sono state alloggiate singolarmente in una scatola di plastica sterile e le loro feci sono state raccolte, immediatamente dopo la defecazione, in un tubo di plastica sterile da 50 ml. L’esame coprologico per campioni aggregati e singoli comprendeva striscio fresco, flottazione centrifuga (2 g di feci per ogni test) utilizzando una soluzione di zucchero e formaldeide (peso specifico 1,27) e test di Baermann (10 g di feci per ogni test)., Inoltre, il muco ottenuto durante l’esame di striscio fresco è stato analizzato al microscopio ottico. Poiché le forme larvali di diverse specie di elminti possono incistare all’interno del muscolo del piede delle lumache, l’esame istologico di campioni bioptici raccolti dalle aree anteriore e posteriore del muscolo del piede è stato eseguito in 30 lumache, anestetizzate con la tecnica descritta da Giannelli et al. (12) e Gilbertson e Wyatt (13)., I campioni bioptici sono stati fissati in formalina tamponata con fosfato neutro al 10% e trattati con metodi di routine in blocchi di paraffina che sono stati tagliati in sezioni spesse 3 µm e colorati con ematossilina ed eosina. Lo studio è stato eseguito sotto il permesso della pratica in cui si è svolto e sotto il consenso informato del proprietario firmato e scritto.

Identificazione morfologica

I supporti temporanei sono stati realizzati da nematodi che uccidono il calore su vetrini in una goccia d’acqua, dopo di che è stato applicato un vetrino di copertura., I nematodi sono stati trasferiti in una goccia di acqua di rubinetto su un vetrino e posti sul riscaldatore (100°C) per 10 s. Questi esemplari sono stati utilizzati per l’identificazione morfologica. Un microscopio ottico AMPLIVAL, Carl Zeiss Jena, e un Diaplan Leitz con ottica Nomarski sono stati utilizzati per l’osservazione., L’identificazione morfologica dei nematodi rabditidi seguì Andrassy (14) e Andrassy (15) ed era principalmente basata sulla morfologia della faringe e dello stoma, e del sistema riproduttivo, principalmente le caratteristiche delle spicole, il numero e la posizione delle papille o la presenza e la dimensione o la forma della borsa per i maschi; e la forma della coda, la posizione della vulva e L’identificazione delle larve era basata sulla forma della coda.

Analisi molecolare

Il DNA è stato estratto da campioni di nematodi ottenuti da feci fissate in etanolo al 96% raccolto dalle tre località., I nematodi sono stati lavati in acqua doppia distillata (ddH2O) durante la notte, prima dell’analisi molecolare, per la completa rimozione dei residui di etanolo. Ogni singolo nematode è stato trasferito in una provetta sterile di Eppendorf (200 µl) con 20 µl di tampone di estrazione (17,7 µl di ddH2O, 2 µl di tampone PCR concentrato 10×, 0,2 µl di 1% tra 20 e 0,1 µl di proteinasi K). Buffer e nematodi sono stati congelati a -20°C per 20 min, quindi immediatamente incubati a 65°C per 1 h, seguiti da 10 min a 95°C., I lisati sono stati raffreddati su ghiaccio e poi centrifugati (2 min, 9.000 g); 1 µl di surnatante è stato utilizzato per la PCR.

Un frammento di rDNA contenente le regioni distanziali trascritte interne (ITS1, 5.8 S, ITS2) è stato amplificato utilizzando primer 18S: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′ (forward) e 28S: 5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′ (reverse) (16). Un frammento di rDNA contenente il gene per 18S rRNA è stato amplificato utilizzando primer 22F: 5′- TCC AAG GAA GGC AGC AG GC-3′ (avanti) e 1080JR: 5′- TCC TGG TGG TGC CCT TCC GTC AAT TTC-3′ (inverso) (17). Il master mix PCR consisteva in: ddH2O, 7.,25µl; tampone PCR 10×, 1,25 µl; trifosfati deossinucleosidici (dNTPs), 1 µl; 0,75 µl di primer avanti e indietro; polimerasi, 0,1 µl; e 1 µl di estratto di DNA. La PCR profili sono stati utilizzati come segue: per il SUO 1 ° ciclo di 94°C per 7 min seguita da 35 cicli a 94°C per 60 s, 50°C per 60 s e 72°C per 60 s, in definitiva, di un allungamento a 72°C per 7 min (14); per i minori di 18 anni 1 ciclo di 94°C per 5 min, seguita da 35 cicli a 94°C per 60 s, 55°C per 90 s e 72°C per 2 min e un finale allungamento a 72°C per 10 min., I prodotti PCR sono stati sequenziati da GATC Biotech (Germania) e successivamente modificati e caricati su GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

Risultati

Il test di Baermann ha rivelato la presenza di larve di nematodi, la cui lunghezza variava da 170 a 336 µm, in tutti i campioni. Uova, larve e nematodi rabditidi adulti sono stati rilevati con metodi di striscio e flottazione freschi in tutti i campioni fecali. Rhabditella axei (Figura 1) è stata identificata morfologicamente da due su tre campioni di feci raggruppati e individuali provenienti da Pozzuoli e Napoli. Inoltre, Rhabditis terricola, Cruznema sp.,, e Pristionchus entomophagus sono stati isolati da una piscina e singoli campioni fecali da Caserta. Nessun parassita è stato rilevato nei campioni di biopsia muscolare o nel muco.

Diversi tipi morfologici di nematodi rabditidi sono stati isolati da feci di lumaca fissate al 96% di etanolo. Le sequenze ottenute e modificate di ITS e 18S di questi nematodi sono state confrontate (ESPLOSIONE) con il materiale in GenBank e identificate come R. axei (18S parziali, numero di adesione MK124578, somiglianza 99%), Rh., terricola (parziale 18S e parziale ITS1, numero di adesione MK156052, somiglianza 100%), P. entomophagus (parziale 18S e parziale ITS1, numero di adesione MK156050, somiglianza 99%) e Cruznema sp. (parziale 18S e parziale ITS1, numero di adesione MK156051, somiglianza 96-100%).

Discussione

I risultati di questo studio indicano che tutte le lumache terrestri africane giganti esaminate depongono uova, larve e nematodi rabditidi adulti nelle feci e possono quindi rappresentare una fonte di infezione per altri animali domestici e umani. Al fine di evitare errori di identificazione con Strongyloides sp.,, una specie di nematodi che mostra una stretta somiglianza con i rabditidi che ha una chiara rilevanza zoonotica parassitaria (14, 15, 18), la diagnosi morfologica iniziale dei nematodi rabditidi è stata confermata attraverso analisi molecolari.

I rabditidi includono nematodi saprofiti a vita libera, ampiamente presenti nel suolo e nei detriti organici dove si nutrono principalmente di batteri. Molte specie di lumache possono servire come ospiti definitivi definitivi per i nematodi rabditidi (14, 15). Tuttavia, un certo numero di specie di rabdite e Rabditella è stato associato a vertebrati inclusi gli esseri umani (14, 15, 19-27)., Sebbene la loro presenza possa essere il risultato di una contaminazione ambientale, questi nematodi possono causare malattie in molti animali e nell’uomo. Rhabditis elongata, Rh. hominis e Rh. le larve di usuii sono state isolate da feci umane, urina e tamponi vaginali (19-21). Tuttavia, non sono stati riportati molti casi di infezioni sintomatiche negli esseri umani (21-24). Feng e Li (25) hanno descritto due casi umani di infezione urinaria da R. axei in Cina e Ahn et al. (20) segnalati cinque casi umani di infezione intestinale con Rhabditis sp. nei bambini delle scuole rurali della Corea del Sud., Allo stesso modo, due casi di infezione intestinale umana da R. axei sono stati descritti in Cina (26), mentre un altro lavoro pubblicato (21) ha riportato un caso di infezione intestinale in un bambino brasiliano di 5 mesi che è stato presentato con febbre e diarrea acquosa e sanguinolenta; l’esame coprologico ha rivelato uova, larve e adulti di Rabdite sp. Meamar et al. (27) ha descritto l’insorgenza di diarrea acquosa in due pazienti iraniani affetti da AIDS, associata a grave infezione intestinale da larve e esemplari adulti di R. axei. Infine, Teschner et al., (24) recentemente descritto un caso di infezione del canale uditivo esterno in un uomo di 37 anni presentato con otorrea purulenta da entrambe le orecchie e perdita acuta dell’udito causata da rabdite sp. In generale, Rhabditis spp. sono considerati una causa comune di otite esterna nei bovini che vivono in aree tropicali (ad esempio, Sud America e Africa), in particolare negli animali più anziani, e sono stati identificati anche in polli, cani e maiali con diarrea incoercibile (18, 28-30). Tuttavia, sono state descritte anche infezioni asintomatiche e questi nematodi sono spesso considerati pseudoparassiti (28, 29).,

Sebbene i nematodi a vita libera siano stati recuperati in tutti i campioni fecali, non sono stati trovati campioni nel muco e nei campioni istologici. Una possibile spiegazione di questa scoperta è che i nematodi possono localizzarsi in diversi tessuti / organi dei loro ospiti, a seconda del tipo di associazione nematode/ospite mollusco (15, 31, 32). Rhabditis spp. completa il suo ciclo vitale all’interno della lumaca, senza danneggiare il suo ospite mollusco. Studi precedenti sulle lumache africane libere (Archachatina spp. e Achatina spp.) ha rivelato che R., axei vive nel tratto gastrointestinale del suo ospite lumaca dove l’intero ciclo di vita del nematode è completato (31-33).

Sebbene le lumache giganti africane siano elencate come ospiti per R. axei, la comparsa di questo nematode è stata segnalata solo in alcune specie di lumache giganti africane diverse da A. fulica, ovvero Archachatina marginata ovum, Ar. marginata saturalis, e Achatina achatina (31). D’altra parte, P. entomophagus ha una distribuzione mondiale ed è stato principalmente associato a coleotteri stercorari appartenenti alla superfamiglia Scarabaeoidea (34, 35), R., terricola è stato trovato in salamandre (14, 15) e Cruznema spp. nel cricket Gryllodes laplatae (Orthoptera) (36). In tutti i casi, la trasmissione del parassita avviene attraverso il contatto delle lumache con terreno umido contaminato ricco di materia organica in decomposizione (31, 37). Sebbene, in questi casi, tutti gli animali siano stati tenuti in terrari con un terreno organico trattato termicamente, ipotizziamo che l’infezione possa essersi verificata prima dell’acquisto degli animali presso i negozi di animali o gli impianti di allevamento.,

In conclusione, i nostri risultati indicano che le lumache terrestri africane giganti possono servire come serbatoio di diversi nematodi rabditidi. Questa specie di lumaca è tra quelle più comunemente tenute come animali domestici, e quindi spesso vivono in prossimità degli esseri umani. Di conseguenza, è possibile la contaminazione dell’ambiente domestico attraverso le loro feci. Sebbene i nematodi parassiti non siano stati isolati in questo studio, le gigantesche lumache terrestri africane dovrebbero ancora essere considerate potenziali portatori di nematodi in grado di causare malattie opportunistiche negli esseri umani., Pertanto, sottolineiamo l’importanza di ulteriori ricerche epidemiologiche sull’insorgenza di nematodi liberi e parassiti nelle lumache gasteropodi tenute in cattività e sottolineiamo la necessità di rigide misure di controllo per ridurre il rischio di infezione opportunistica con nematodi rabditidi nei proprietari di lumache da compagnia.

Contributi dell’autore

Dd’O e MS hanno concepito e pianificato l’analisi. MS e JN hanno effettuato l’analisi. CA ha contribuito a plasmare la ricerca e curato il manoscritto. Tutti gli autori hanno fornito feedback critici e contribuito al manoscritto finale.,

Dichiarazione sul conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

PubMed Abstract/Google Scholar