Flow Cytometry vs. FACS: Qual è la differenza?
La citometria a flusso e FACS (fluorescence activated cell sorting) sono procedure distintamente diverse sebbene FACS sia una procedura discendente basata su protocolli di citometria a flusso. I progressi nella tecnologia di smistamento delle cellule stanno contribuendo in modo importante al panorama delle scienze molecolari., I contributi complessivi di ciò che si apprende sono ciò che guida il processo di scoperta farmaceutica sia in termini di capacità diagnostica che di sforzi terapeutici che a loro volta portano a risultati migliori del paziente1.
Che cos’è la citometria a flusso?
La citometria a flusso è un metodo utilizzato per esaminare e determinare l’espressione delle molecole intracellulari e la superficie cellulare e per definire e caratterizzare tipi distinti di singole cellule. Viene anche utilizzato per determinare il volume delle cellule, la dimensione delle cellule e valutare la purezza delle sottopopolazioni isolate., Ciò consente la valutazione multi-parametro di singole celle all’incirca nello stesso momento.
Una citometria a flusso è uno strumento potente perché consente l’analisi simultanea di caratteristiche fisiche e chimiche fino a migliaia di particelle al secondo. Questo lo rende un metodo rapido e quantitativo per l’analisi e la purificazione in sospensione cellulare. Usando il flusso, possiamo determinare il fenotipo e la funzione e persino ordinare le cellule vive., i
Alcune delle applicazioni di misura adottate tramite citometria a flusso sono:
- funzione Piastrinica
- midollo Osseo
- sangue Periferico
I due potenziale di citometria a flusso di dati di espressione formati includono:
- istogrammi che misura o confrontare solo un singolo parametro,
- dot-plot che confrontare 2 o 3 parametri contemporaneamente su due o tre dimensioni del grafico a dispersione.
Che cos’è FACS?,
FACS è un’abbreviazione per l’ordinamento a cellule singole attivato dalla fluorescenza, che è una tecnica di citometria a flusso che aggiunge ulteriormente un grado di funzionalità. Utilizzando anticorpi altamente specifici etichettati con coniugati fluorescenti (una molecola fluorescente chiamata fluorocromo), l’analisi FACS ci consente di raccogliere simultaneamente dati e ordinare un campione biologico in base a un numero quasi illimitato di parametri diversi. Proprio come nella citometria a flusso convenzionale, vengono raccolti dati di segnale forward-scatter, side-scatter e fluorescenti.,i
Utilizzando una macchina citometro a flusso, cellule o altre particelle sospese in un flusso di liquido sono passati attraverso un fascio laser in modo singolo file, e l’interazione con la luce laser è misurata da un apparecchio rivelatore di luce elettronica come dispersione della luce e l’intensità di fluorescenza. Se un marcatore fluorescente è legato a un componente cellulare, l’intensità della fluorescenza rappresenterà idealmente la quantità di quel particolare componente della cella di flusso.
Lo smistamento delle celle tramite strumentazione avanzata di smistamento delle celle viene eseguito con elevata specificità e standard elevati., Ai ricercatori piace usare i metodi di citometria a flusso perché è il modo più rapido ed efficace per applicare la misurazione all’intero processo cellulare. L’operatore predetermina o seleziona determinati parametri su come le celle devono essere ordinate. i
A questo punto, la macchina di smistamento delle celle impone una carica elettrica su ciascuna cella in modo che le celle vengano ordinate per carica (usando elettromagneti) in vasi separati all’uscita dalla camera di flusso. La tecnologia per ordinare fisicamente una miscela eterogenea di cellule in diverse popolazioni è utile per molte applicazioni terapeutiche e cliniche.,
Comprendere la relazione tra FACS e citometria a flusso
Per dirla con la relazione tra analisi FACS e citometria a flusso in un contesto semplice, sono fondamentalmente partner nel processo di analisi cellulare. FACS viene utilizzato come selezionatore di cellule e arricchito per un sottoinsieme di cellule che viene spesso studiato in dettaglio utilizzando la citometria a flusso o altre tecniche analitiche2.
La citometria a flusso viene utilizzata per l’analisi cellulare e si concentra sulla misurazione dell’espressione proteica o della co-espressione all’interno di una popolazione mista di cellule., Sia la citometria a flusso che il FACS sono sviluppati per differenziare le cellule secondo i loro filtri ottici.
La distinzione chiave tra le due modalità di caratterizzazione delle celle risiede nella funzionalità del metodo utilizzato.
Sia la citometria a flusso che i FAC tendono ad essere usati in modo intercambiabile. Sono entrambi sviluppati per differenziare le cellule in base alle loro proprietà ottiche. Tuttavia, ci sono alcune differenze nella metodologia che sono distinte e hanno diversi risultati procedurali., Usato singolarmente i risultati sono unilaterali e usati insieme, i risultati sono dati di espressione da più parametri di cellula3.
–FACS è un processo mediante il quale una miscela campione di cellule viene ordinata in base alle loro caratteristiche di dispersione della luce e fluorescenza in due o più contenitori.
–La citometria a flusso è una metodologia che viene utilizzata durante l’analisi di una popolazione eterogenea di cellule in base a diverse molecole di superficie cellulare, dimensioni e volume che consente l’indagine di singole cellule.,
-FACS insieme alla citometria a flusso può misurare e caratterizzare più generazioni di cellule utilizzando anticorpi altamente specifici etichettati con coloranti fluorescenti, un ricercatore può eseguire analisi FACS e contemporaneamente raccogliere dati di espressione e ordinare campioni di cellule per un numero di variabili.
Come citometria a flusso e FACS sono utilizzati in applicazioni cliniche
Immunofenotipizzazione: Uno dei formati di applicazione più comuni utilizzati è immunofenotipizzazione. Questa è una metodologia che identifica e quantifica più popolazioni di cellule in un campione eterogeneo., Questo include sangue periferico, midollo osseo e materiale linfatico. Immunofenotipizzazione è utilizzato principalmente in contesti ematologici per diagnosticare alcuni tumori cioè linfoma maligno e / o leucemia4.
Ordinamento delle cellule: I progressi nelle selezionatrici delle cellule sono orientati verso il delicato isolamento delle cellule in tubi separati. Misuratori di portata specializzati con la capacità di interrogare e caratterizzare ogni cella mentre passa attraverso il laser ed esprimere dati di misurazione cruciali della cella., La chiave qui è misurata anche in senso quantitativo: la strumentazione è in grado di gestire grandi volumi che rendono obsoleto l’esame microscopico.
Analisi del ciclo cellulare: Con citometria a flusso e FACS, la cellula può essere analizzata e misurata in tutte e quattro le fasi distinte dell’intero ciclo cellulare. I test basati sulle cellule possono quindi aiutare con la determinazione delle anomalie cellulari utilizzando alcuni coloranti fluorescenti. Il campo della genomica unicellulare utilizza entrambi questi metodi per studiare un singolo tipo di cellula per una popolazione cellulare.,
Apoptosi: l’apoptosi, o morte cellulare programmata, è una parte normale del ciclo di vita delle cellule eucariotiche. Le cellule muoiono per una serie di motivi: attraverso la necrosi, causata da cambiamenti fisici e chimici esterni alla cellula o attraverso l’apoptosi, un processo in cui le cellule iniziano un programma di “suicidio” attraverso fattori controllati internamente. Questi due tipi distinti di morte cellulare, apoptosi e necrosi, possono essere identificati tramite la metodologia citometrica a flusso e utilizzati per determinare i cambiamenti morfologici, biochimici e molecolari che si verificano nelle cellule morenti.,
Analisi di proliferazione cellulare: i saggi basati sulle cellule sono uno degli strumenti chiave per misurare le risposte del meccanismo d’azione a determinati stimoli come fattori di crescita, citochine e altri componenti dei media. Il citometro a flusso può misurare la proliferazione etichettando le cellule a riposo con un colorante fluorescente a membrana cellulare, carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE). Quando le cellule vengono attivate, iniziano a proliferare e subiscono la mitosi. Quando le cellule si dividono, metà del colorante originale viene trasmesso a ciascuna cellula figlia., Misurando la riduzione del segnale di fluorescenza, i ricercatori possono calcolare l’attivazione e la proliferazione cellulare.
Intracellulare calcio Flux: Le cellule interagiscono commingle all’interno del loro ambiente attraverso vie di trasduzione del segnale. Quando queste vie sono attivate, i canali ionici del calcio legati alla membrana pompano il calcio nella cellula e aumentano rapidamente la concentrazione intracellulare di calcio. I livelli di calcio più elevati forniscono alla cellula energia per rispondere. Il citometro a flusso è in grado di rilevare il flusso di calcio nella cellula e fornire dati di misurazione dettagliati5.,
Avvolgimento
L’espansione delle tecniche citometriche di flusso per valutare le caratteristiche intracellulari sta spostando questa piattaforma nell’arena della determinazione della funzione cellulare. Questi approcci più recenti stanno espandendo l’utilità della citometria a flusso come uno strumento prezioso per una comprensione più profonda della funzione immunitaria e del ruolo di alcune cellule mentre inizia a rivelare indicatori di apoptosi., Migliorando la vitalità delle chiamate attraverso una tecnologia migliorata e riconoscendo la morte cellulare o l’apoptosi, la tecnologia serve ad aiutare i ricercatori a capire perché accade e i cambiamenti biochimici che si verificano specifici per ogni fase dell’attività cellulare. Tracciare i percorsi del segnale e la frammentazione del DNA è una tecnica che i genetisti molecolari stanno trovando molto preziosa. Le soluzioni terapeutiche basate sull’mRNA sembrano essere fondamentali per risolvere alcuni degli enigmi associati alla malattia sistemica6.,
Mentre ci avviciniamo alla possibilità di sfruttare il processo analitico cellulare tramite tecnologia 3D, è facile vedere come le conoscenze acquisite porteranno a una maggiore innovazione. La comunità di ricerca non vede l’ora di estendere la coperta della scienza molecolare per includere la tecnologia delle cellule staminali. Con le cellule staminali e la capacità di clonarle in modo efficace e introdurle al corpo per creare il cambiamento del sistema è dove il futuro sta andando., Possiamo vedere come la citometria a flusso e la diversa metodologia di FACS alla fine si tradurranno in risultati più positivi per i pazienti, interventi terapeutici e forse una lisi completa di un giorno di tumori cancerosi. La malattia genetica sta rapidamente diventando scoperta e l’esposizione di molte nuove scoperte ha dato il via a un nuovo movimento della scienza biologica e molecolare7.
Fonti:
2 2https: / / www.sciencedirect.,com/science/article/abs/pii/0022175981902532
3 https://sciencing.com/understand-flow-cytometry-results-5805206.html
4 https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/immunophenotyping
5 https://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1177/1087057104264038
6 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4623474/
7 https://www.nature.com/scitable/topicpage/cdk-14046166/