Definizione elettroforesi su gel
L’elettroforesi su gel è una procedura utilizzata per separare le molecole biologiche in base alle dimensioni. La separazione di queste molecole si ottiene posizionandole in un gel con piccoli pori e creando un campo elettrico attraverso il gel. Le molecole si muoveranno più velocemente o più lentamente in base alle loro dimensioni e alla carica elettrica.,
Elettroforesi su gel Panoramica
Il processo di elettroforesi su gel funziona perché le molecole caricate negativamente si allontanano dal polo negativo della corrente elettrica e le molecole più piccole si muoveranno più velocemente delle molecole più grandi. Pertanto, si ottiene una separazione delle dimensioni all’interno del pool di molecole che attraversano il gel. Il gel funziona in modo simile a un setaccio che separa le particelle per dimensione. L’elettroforesi lavora per spostare le particelle, usando la loro carica elettrica intrinseca, attraverso il setaccio.,
Quando i ricercatori stanno cercando di distinguere tra diversi segmenti di DNA, ad esempio, il processo è semplice. I campioni vengono caricati nei canali all’inizio del gel. Ogni molecola di DNA ha la stessa carica (-1), perché il DNA è formato dagli stessi 4 nucleotidi e porta sempre una carica leggermente negativa indipendentemente dalle sue dimensioni. Pertanto, ogni molecola di DNA avrà la stessa forza tirandola attraverso il gel.
Tuttavia, la dimensione di ogni molecola ostacola il suo progresso attraverso il gel., Le grandi molecole colpiscono parti della matrice di gel e vengono rallentate. Piccole molecole di DNA possono scivolare tra i vari componenti della matrice del gel e rapidamente si fanno strada verso l’altro lato del gel. Dopo un certo periodo di tempo, le molecole di DNA tinte possono essere viste aggregarsi in diverse aree del gel, in base a quanto si sono mosse durante l’elettroforesi su gel. Ciò consente ai ricercatori di identificare i segmenti e confrontare il DNA di diversi organismi.
Per che cosa si usano le elettroforesi su gel?,
Lo scopo dell’elettroforesi su gel è quello di visualizzare, identificare e distinguere le molecole che sono state elaborate con un metodo precedente come la PCR, la digestione enzimatica o una condizione sperimentale. Spesso, le miscele di acidi nucleici o proteine raccolte da un precedente esperimento / metodo vengono eseguite attraverso l’elettroforesi su gel per determinare l’identità o differenziare tra le molecole.,
Elettroforesi su Gel di Passi
La serie di passi coinvolti in un DNA comune di elettroforesi su gel di protocollo:
la Preparazione dei campioni per l’esecuzione di
Il DNA è isolato ed elaborati (ad esempio, PCR, digestione enzimatica) e in soluzione con un po ‘ di colorante blu per aiutare a visualizzare il movimento del campione attraverso il gel.
Viene preparata una soluzione di gel di agarosio TAE
Il tampone TAE fornisce una fonte di ioni per impostare il campo elettrico durante l’elettroforesi., La concentrazione peso-volume di agarosio nel tampone TAE viene utilizzata per preparare la soluzione. Ad esempio, se è richiesto un gel di agarosio all ‘ 1%, 1 g di agarosio viene aggiunto a 100 ml di TAE. La percentuale di agarosio utilizzata è determinata da quanto grande o piccolo il DNA dovrebbe essere. Se si sta cercando di separare un pool di bande di DNA di dimensioni più piccole (<500bp), viene preparato un gel di agarosio percentuale più alta (>1%). La più alta percentuale di agarosio crea un setaccio più denso per aumentare la separazione delle piccole differenze di lunghezza del DNA., La soluzione di agarosio-TAE viene riscaldata per sciogliere l’agarosio.
Colare il gel
La soluzione di TAE di agarosio viene versata in un vassoio di fusione che, una volta raffreddata e solidificata la soluzione di gel, crea una lastra di gel con una fila di pozzetti nella parte superiore.
Impostazione della camera di elettroforesi
Il gel solido viene inserito in una camera riempita con tampone TAE. Il gel è posizionato in modo che i pozzetti della camera siano più vicini all’elettrodo negativo della camera.,
Caricamento del gel
I pozzetti della camera del gel vengono caricati con i campioni di DNA e di solito viene caricata anche una scala di DNA come riferimento per le dimensioni.
Elettroforesi
I conduttori negativo e positivo sono collegati alla camera e ad un alimentatore in cui è impostata la tensione. L’accensione dell’alimentatore imposta il campo elettrico e i campioni di DNA caricati negativamente inizieranno a migrare attraverso il gel e lontano dall’elettrodo negativo verso il positivo.,
Fermare l’elettroforesi e visualizzare il DNA
Una volta che il colorante blu nei campioni di DNA è migrato attraverso il gel abbastanza lontano, l’alimentazione viene spenta e il gel viene rimosso e inserito in una soluzione di bromuro di etidio. Il bromuro di etidio intercala tra il DNA ed è visibile alla luce UV. A volte il bromuro di etidio viene aggiunto direttamente alla soluzione di gel di agarosio nel passaggio 2. Il gel macchiato di bromuro di etidio viene quindi esposto alla luce UV e viene scattata una foto. Le bande del DNA sono visualizzate dentro da ogni vicolo che corrisponde ad un pozzo della camera., La scala di DNA che è stato caricato è anche visualizzato e la lunghezza delle bande di DNA può essere stimata. Un esempio è dato nella figura seguente.
Tipi di elettroforesi su gel
Esistono due tipi di elettroforesi su gel: nativa e denaturante. L’elettroforesi nativa del gel di solito tenta di mantenere l’RNA o la proteina nella sua struttura nativa durante l’esecuzione attraverso il gel., L’elettroforesi su gel denaturante tenta di ridurre l’RNA o la proteina nella sua struttura più lineare prima o durante l’elettroforesi su gel.
La denaturazione dell’RNA o della proteina si ottiene aggiungendo un agente riducente al campione, al gel e / o al tampone. L’agente riducente separa i legami all’interno dell’RNA o della molecola proteica e quindi riduce la sua struttura secondaria. La struttura secondaria di una proteina o RNA influenzerà, in modo non lineare, la velocità con cui migra attraverso un gel., Una forma denaturata e lineare di RNA o proteina, tuttavia, migrerà proporzionalmente alla sua dimensione lineare (coppie di basi o dalton al chilo). L’elettroforesi su gel denaturante è spesso più accurata per l’identificazione delle dimensioni, mentre l’elettroforesi su gel nativa viene solitamente utilizzata per identificare complessi proteici più grandi.
Esempi di elettroforesi su gel
- TAE L’elettroforesi su gel di agarosio è più comunemente usata per il DNA.
- TBE e Denaturazione PAGINA (poliacrilammide gel elettroforesi) sono comuni per la separazione di RNA.,
- SDS PAGE è un’elettroforesi su gel denaturante comunemente utilizzata per l’identificazione e la separazione delle proteine.