Che cos’è l’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGINA)?

Le tecniche elettroforetiche separano le molecole cariche in un campo elettrico. La mobilità di una molecola è inversamente proporzionale alla sua dimensione e direttamente proporzionale alla sua carica. Durante l’elettroforesi, le proteine si muovono verso un elettrodo caricato in modo opposto in un campo elettrico.,

La velocità del loro movimento in un sistema elettroforetico è governata da diversi fattori quali temperatura, pH e concentrazione tampone oltre alle proprietà intrinseche come la dimensione, la carica e la forma delle proteine.

La separazione elettroforetica delle proteine rigorosamente sulla base del loro peso molecolare è possibile solo se la carica di tutte le molecole proteiche può essere manipolata allo stesso segno. In tal caso, la mobilità delle molecole proteiche dipenderà esclusivamente dalle loro dimensioni.,

L’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) è una tecnica basata su questa idea e viene utilizzata per separare le proteine in base alle loro dimensioni.

Principi di PAGE

In PAGE, un detergente anionico chiamato sodio dodecil solfato (SDS) viene utilizzato per legarsi alle proteine e dare loro una carica negativa. Le proteine vengono quindi separate elettroforeticamente in base alle loro dimensioni utilizzando una matrice di gel in poliacrilammide in un campo elettrico.

La poliacrilammide viene prodotta come risultato della reazione di polimerizzazione tra acrilammide e N,N’-metilene-bis-acrilammide (BIS) utilizzando un catalizzatore., Il grado di polimerizzazione o reticolazione può essere controllato regolando la concentrazione di acrilammide e BIS.

Più il cross-linking più duro è il gel. La durezza del gel, a sua volta, modula l’attrito sperimentato dalle macromolecole quando viaggiano attraverso il gel durante la PAGINA, influenzando così la risoluzione della separazione.

I gel sciolti (4-8% acrilammide) consentono alle molecole di peso molecolare superiore di migrare più velocemente attraverso il gel mentre i gel duri (12-20% acrilammide) limitano la migrazione di molecole di grandi dimensioni e consentono selettivamente a quelle piccole di muoversi attraverso il gel.,

Protocollo SDS-PAGE

1. Preparazione del campione:

I campioni di proteine vengono denaturati riscaldandoli con un detergente SDS e mercaptoetanolo. Il primo si lega fortemente alle proteine e dà loro un’alta carica negativa mentre il secondo libera i gruppi sulfidrilici, producendo così catene polipeptidiche che trasportano una carica negativa in eccesso e una carica simile al rapporto di massa. Questo aiuta la risoluzione delle proteine rigorosamente in base alle loro dimensioni durante l’elettroforesi su gel.

2., Preparazione del gel:

Il gel elettroforetico di solito ha diversi componenti tra cui acrilammide, BIS e un tampone. La miscela viene degassata per prevenire la formazione di bolle durante la polimerizzazione del gel. Persolfato di ammonio, una fonte di radicali liberi e uno stabilizzatore vengono aggiunti per iniziare la polimerizzazione. Il BIS inoltre è aggiunto per formare i collegamenti trasversali fra le molecole dell’acrilammide fino a formare infine un gel.

3. Elettroforesi:

Quando viene applicata una corrente elettrica, le proteine migrano attraverso il gel verso l’elettrodo positivo poiché hanno una carica negativa., Ogni molecola si muove ad una velocità diversa in base al suo peso molecolare – piccole molecole si muovono più rapidamente attraverso il gel rispetto a quelle più grandi. La migrazione è solitamente più veloce a tensioni più elevate. Dopo alcune ore, le molecole proteiche sono tutte separate per dimensione.

4. Colorazione e visualizzazione:

Una volta completata l’elettroforesi, il gel può essere colorato utilizzando coloranti colorati come il blu brillante di Coomassie o il bromuro di etidio per far apparire le proteine separate come bande colorate distinte sul gel.

Il colorante non legato viene lavato dal gel., I gel colorati vengono quindi essiccati in modo da poter misurare l’intensità del colore delle bande proteiche. Bande di proteine radioattive possono essere rilevate mediante autoradiografia. Le proteine possono anche essere quantificate in quanto il contenuto proteico è direttamente proporzionale alla quantità del colorante legato.

Alcuni sistemi di gel introducono un colorante di tracciamento come il blu di bromofenolo insieme al campione di proteine – la distanza visibile percorsa dal colorante sul gel aiuta a decidere la durata richiesta dell’elettroforesi., Il blu del bromofenolo viaggia con le molecole del campione fino a raggiungere infine il fondo del gel. L’elettroforesi deve fermarsi a questo punto per garantire che non ci siano molecole proteiche elettroforesi fuori dal gel e nel buffer.

bibliografia

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