gélelektroforézis meghatározás
a gélelektroforézis a biológiai molekulák méret szerinti elválasztására szolgáló eljárás. Ezeknek a molekuláknak a szétválasztását úgy érik el, hogy kis pórusú gélbe helyezik őket, és elektromos mezőt hoznak létre a gélen. A molekulák méretük és elektromos töltésük alapján gyorsabban vagy lassabban mozognak.,
gélelektroforézis áttekintés
a gélelektroforézis folyamata azért működik, mert a negatív töltésű molekulák távolodnak az elektromos áram negatív pólusától, a kisebb molekulák pedig gyorsabban mozognak, mint a nagyobb molekulák. Így a gélen áthaladó molekulák medencéjén belül méret-elválasztás érhető el. A gél hasonló módon működik, mint egy szemcséket méret szerint elválasztó szitán. Az elektroforézis a részecskék mozgatására szolgál, a benne rejlő elektromos töltéssel, a szitán keresztül.,
amikor a kutatók megpróbálják megkülönböztetni a DNS különböző szegmenseit, például a folyamat egyszerű. A mintákat a gél elején csatornákba töltik. Minden DNS-molekula azonos töltéssel (-1) rendelkezik,mivel a DNS-t ugyanaz a 4 nukleotid alkotja, és méretétől függetlenül mindig enyhén negatív töltést hordoz. Ezért minden DNS-molekula ugyanolyan erővel húzza át a gélen.
azonban az egyes molekulák mérete akadályozza annak előrehaladását a gélen keresztül., A nagy molekulák a gélmátrix egyes részeit érintik, és lelassulnak. A kis DNS-molekulák a gélmátrix különböző komponensei közé csúszhatnak, és gyorsan eljuthatnak a gél másik oldalára. Bizonyos idő elteltével a festett DNS-molekulák a gél különböző területein aggregálódnak, attól függően, hogy milyen messzire mozogtak a gél elektroforézis során. Ez lehetővé teszi a kutatók számára, hogy azonosítsák a szegmenseket, és összehasonlítsák a különböző szervezetek DNS-ét.
milyen betegségek esetén alkalmazható a gél-elektroforézis?,
a gél elektroforézis célja olyan molekulák ábrázolása, azonosítása és megkülönböztetése, amelyeket egy korábbi módszerrel, például PCR-vel, enzimes emésztéssel vagy kísérleti állapottal dolgoztak fel. Gyakran, keverékeket a nukleinsav vagy fehérjék, amelyek gyűjtött egy korábbi kísérlet/módszer fut át gél elektroforézis megállapítani a személyazonosságát, illetve megkülönböztetni a molekulák között.,
Gél Elektroforézis Lépéseket
A széles lépéseket vett részt a közös DNS-gél elektroforézis jegyzőkönyv:
a minták előkészítésére a futó
A DNS elszigetelt preprocessed (pl. PCR, enzimatikus emésztés) pedig kitaláltam a megoldást néhány alapvető kék festék, hogy segítsen elképzelni a mozgás a mintát a gél.
agaróz Tae géloldatot készítenek
TAE puffer ionforrást biztosít az elektroforézis során az elektromos mező beállításához., Az oldat elkészítéséhez az agaróz tömeg / térfogat koncentrációját Tae pufferben használják. Például, ha 1% agaróz gélre van szükség, 1 g agarózt adunk 100 ml TAE-hoz. Az alkalmazott agaróz százalékos arányt az határozza meg, hogy a DNS milyen nagy vagy kicsi lesz. Ha egy kisebb méretű DNS-sávok (<500bp) elválasztását nézzük, akkor magasabb százalékos agarózgélt (>1%) készítünk. Az agaróz nagyobb százaléka sűrűbb szitát hoz létre, hogy növelje a kis DNS-hosszúságú különbségek elválasztását., Az agarose-TAE oldatot melegítjük, hogy feloldjuk az agarózt.
A gélt öntve
az agaróz Tae oldatot öntőtálcába öntjük, amely miután a géloldat lehűlt és megszilárdult, egy géllemezt hoz létre, amelynek tetején egy sor kút található.
az elektroforézis kamra beállítása
a szilárd gélt Tae pufferrel töltött kamrába helyezzük. A gél úgy van elhelyezve, hogy a kamra kutak a legközelebb legyenek a kamra negatív elektródájához.,
A gél betöltése
a gélkamrás kutak DNS-mintákkal vannak betöltve, és általában egy DNS-létrát is betöltenek a méretek referenciájaként.
elektroforézis
a negatív és pozitív vezetékek a kamrához és a tápegységhez vannak csatlakoztatva, ahol a feszültség be van állítva. A tápellátás bekapcsolásával létrejön az elektromos mező, és a negatív töltésű DNS-minták elkezdenek átvándorolni a gélen, majd a negatív elektródától a pozitív felé.,
az elektroforézis leállítása és a DNS láthatóvá tétele
miután a DNS-mintákban lévő kék festék elég messzire vándorolt a gélen, a tápegységet kikapcsolják, a gélt eltávolítják és etidium-bromid oldatba helyezik. Etidium-bromid interkalátok a DNS között, UV fényben látható. Néha az etidium-bromidot közvetlenül az agaróz géloldathoz adják a 2. lépésben. Az etidium-bromid festett gélt ezután UV-fénynek tesszük ki, és lefényképezzük. A DNS-sávokat minden sávból megjelenítik, amely megfelel egy kamrának., A betöltött DNS-létra is látható, a DNS-sávok hossza pedig becsülhető. Egy példa az alábbi ábrán látható.
A gélelektroforézis típusai
kétféle gélelektroforézis létezik: natív és denaturáló. A natív gélelektroforézis általában megpróbálja megtartani az RNS-t vagy a fehérjét a natív szerkezetében, miközben a gélen keresztül fut., A denaturáló gél elektroforézis megpróbálja csökkenteni az RNS-t vagy a fehérjét a leglineárisabb szerkezetébe a gél elektroforézis előtt vagy alatt.
az RNS vagy fehérje denaturálása redukálószer hozzáadásával történik a mintához, gélhez és / vagy pufferhez. A redukálószer elválasztja az RNS-vagy fehérjemolekulán belüli kötéseket, ezáltal csökkenti másodlagos szerkezetét. A fehérje vagy RNS másodlagos szerkezete nemlineáris módon befolyásolja, hogy milyen gyorsan vándorol át egy gélen., Az RNS vagy fehérje denaturált, lineáris formája azonban arányosan vándorol a lineáris méretéhez (bázispárok vagy kilo Daltonok). A denaturáló gél elektroforézis gyakran pontosabb a méret azonosításához, míg a natív gélelektroforézist általában nagyobb fehérjekomplexek azonosítására használják.
példák gél elektroforézis
- TAE agaróz gél elektroforézis leggyakrabban használt DNS.
- a TBE és a denaturáló oldal (poliakrilamid gélelektroforézis) gyakori az RNS-elválasztásnál.,a
- SDS PAGE egy denaturáló gélelektroforézis, amelyet általában a fehérje azonosítására és szétválasztására használnak.