Ez az anyag kíséri egy előadást fehérje szerkezet, elvek mögött denaturálási minták, illetve nem folyamatos gél elektroforézis.
a makromolekulák elektromos mezőben történő elválasztását elektroforézisnek nevezzük. Egy nagyon gyakori módszer a fehérjék elektroforézissel történő elválasztására egy nem folytonos poliakrilamid gélt alkalmaz támogató közegként és nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) a fehérjék denaturálására. Az eljárást nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél elektroforézisnek (SDS-oldal) nevezik., A leggyakrabban használt rendszer is nevezik a Laemmli módszer után U. K. Laemmli, aki volt az első, hogy közzé egy papírt alkalmazó SDS-oldal egy tudományos tanulmány.
az SDS (más néven lauril-szulfát) egy anionos mosószer, ami azt jelenti, hogy feloldásakor molekulái nettó negatív töltéssel rendelkeznek széles pH-tartományban. A polipeptidlánc az SDS mennyiségét a relatív molekulatömeg arányában köti össze. Az SDS negatív töltései elpusztítják a fehérjék komplex szerkezetének nagy részét, és erősen vonzódnak egy anód (pozitív töltésű elektróda) felé egy elektromos mezőben.,
a poliakrilamid gélek gátolják a nagyobb molekulákat abban, hogy olyan gyorsan vándoroljanak, mint a kisebb molekulák. Mivel a töltés-tömeg arány közel azonos az SDS-denaturált polipeptidek között, a fehérjék végső szétválasztása szinte teljes mértékben függ a polipeptidek relatív molekulatömegének különbségeitől. Egy egyenletes sűrűségű gélben a fehérje relatív migrációs távolsága (Rf, f mint alindex) negatívan arányos a tömegének naplójával., Ha az ismert tömegű fehérjék az ismeretlenekkel párhuzamosan futnak, akkor az Rf és a tömeg közötti kapcsolat ábrázolható,és az ismeretlen fehérjék tömegei becsülhetők.
az SDS-PAGE fehérje elválasztása felhasználható a relatív molekulatömeg becslésére, a mintában lévő főbb fehérjék relatív bőségének meghatározására, valamint a fehérjék frakciók közötti eloszlásának meghatározására. A fehérjeminták tisztasága felmérhető, és követhető a frakcionálási vagy tisztítási eljárás előrehaladása., Különböző festési módszerek alkalmazhatók a ritka fehérjék kimutatására, valamint biokémiai tulajdonságaik megismerésére. Speciális technikák, mint a Western blot, kétdimenziós elektroforézis, valamint peptid feltérképezése lehet felismerni rendkívül szűkös géntermék, hogy megtalálja a hasonlóság köztük, s felismerni, külön izoenzimek a fehérjék.
Molekulatömeg versus molekulatömeg
a molekulatömeget (m szimbólum) Daltonokban (Da) fejezzük ki. Egy Dalton definíciója 1/12 a szén tömege 12., A legtöbb makromolekulák elég nagyok ahhoz, hogy a kilodalton (kDa) leírására molekuláris tömege. A molekulatömeg nem ugyanaz, mint a molekulatömeg. Relatív molekulatömegként is ismert (Mr szimbólum, ahol r egy alsó index). A molekulatömeget úgy definiáljuk, mint egy makromolekula tömegének aránya 1/12-re egy szén-12 atom tömegéhez. Ez egy méret nélküli mennyiség.
amikor a szakirodalom da-ban vagy kDa-ban tömeget ad, molekulatömegre utal. Helytelen a molekulatömeg (relatív molekulatömeg) kifejezése Daltonokban., Ennek ellenére néhány irodalomban megtalálja a Daltonokkal vagy kilodaltonokkal használt molekulatömeg kifejezést, gyakran az MW rövidítést használva a molekulatömegre.
Polyakrylamide gels for SDS-PAGE
számos fehérje elektroforézis-rendszert fejlesztettek ki, és az SDS-PAGE-hez használt készülékek széles skálán mozognak. Az ezeken az oldalakon alkalmazott módszer a Laemmli módszert alkalmazza. A laemmli módszerre való hivatkozás az anyagok és módszerek szakaszban kiküszöböli a pufferek, gélek, készülékek stb., Hacsak a papír nem alkalmaz valamilyen módosítást a módszerhez, az SDS-PAGE egyetlen részlete, amelyet egy metódus szakaszban jelenteni kell, a gélben lévő teljes akrilamid (%t) százaléka, relatív százalék és keresztkötő típusa (%C), és talán a gél méreteire való hivatkozás. “Mini-gél” rendszert használunk, 3 1/4″ x 4 ” gélkazettával.
az SDS-PAGE előöntött géleken is elvégezhető, így elkerülhető az akrilamiddal való munkavégzés problémája és veszélye. A következő leírás a kereskedelmi forgalomban kapható berendezéseknél jóval olcsóbb, boltból készült öntő-és futóberendezésekre vonatkozik., A költséghatékonyság mellett a saját gélek első elkészítésének előnye a folyamat mélyebb megértése.
a rendszertől függetlenül az előkészítéshez két különböző akrilamid réteg öntése szükséges az üveglemezek között. Az alsó réteg (elválasztó vagy feloldó gél) felelős a polipeptidek méret szerinti tényleges elválasztásáért. A felső réteg (stacking gél) magában foglalja a minta kutak. Úgy tervezték, hogy a fehérjéket egy mintában két mozgó határ között söpörje úgy, hogy mikrométer vékony rétegekbe tömörítsék őket, amikor elérik az elválasztó gélt.,