Kísérleti Ellenőrzése Modellek
Az első megközelítés (3) azonosítani a primer beavatás helyek 14 fehérjék, beleértve a szarvasmarha-hasnyálmirigy RNase Egy ámbráscet mioglobin, valamint más, kevésbé stabil beavatási helyek (11) a RNase A. A primer beavatás oldal RNase Egy megállapította, hogy ez a modell, mint a maradékok 106-118. A második megközelítés (8) alkalmazása az RNase a (13) – ra hat helyszínre vezetett (az ábra szemlélteti., 3 a), amelyek összhangban voltak azokkal, amelyeket az első megközelítés (11) azonosított (3). Ezek a 4-11. (a régió), a 25-34. (B régió), az 53-67. (C régió) maradékanyagok és a 69-79. (d régió) maradékanyagokkal (d régió), a 91-111. (e régió) maradékanyagokkal (e régió), valamint a 103-111. (F régió) maradékanyagokkal (F régió) alkotott parallel-szerkezetek (nem feltétlenül rakott lapok), valamint a 115-124. (F régió) maradékanyagok. A következő lépések a hajtogatási út mentén e régiók növekedéséből vagy összeolvadásából állnak. A G régió akkor alakul ki, ha a maradványok 36-48-szorosak a hélix B ellen., Régió G, azonban tartalmaz, hosszabb távú kapcsolatok, mint a helix B. Ezért G tartják, hogy a forma egy későbbi időpontban, mint B. Régió L képzettársítás a régió, B -, G -, valamint C-strukturális sorrendet követi régió H, alakul ki, amikor a régiók C D érintkeznek; régiónként K tartalmazó névjegyzék régiók közötti E, F; régió szerint J, amelyben a régiók C D formája kapcsolattartás régiók, E, F; valamint a régió én tartalmazó névjegyzék a régiók E s H a G. Végül, a régió M keletkezik, amikor a régió Egy érintkezik E-F.,
A várható elsődleges összecsukható beavatás helyén RNase Egy egyetért a megfigyelt viszont a maradékok 113, valamint 114 a natív molekula, a nagyon magas fokú természetvédelmi nonpolar maradékok oldalon 106-118 23 emlős faj ez a fehérje (3), valamint a kísérleti adatokat a intermedierek észlelt a termikus kibontakozó RNase A (14)., NMR bizonyíték a helyi szerkezet bontakozott ki RNase Egy alatt összecsukható feltételek (15), valamint a töredékek annak (16), valamint immunkémiai vizsgálatok a kialakulását stabil antigén-oldalak (a felszínen a fehérje, amely a eltemetve elsődleges hidrofób beavatás oldal, ha csökkentett RNase Egy oxidálódik (ref. A ref.17. és 8. ábrája. 18), szintén összhangban voltak ezzel a képpel. Az A-F kezdeményezési helyek meglétét alátámasztó egyéb kísérleti bizonyítékokat a ref. 11.,
az apomyoglobin esetében az első megközelítés (3) az elsődleges hajtogatási helyet 103-115 szermaradékként azonosította, amely magában foglalja a G spirál nagy részét, a Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-Glu-Ala-Ile-his-Val-Leu szekvenciával., A kérelmet a második megközelítés (8), valamint conformational-energetikai számításokat, led, hogy a javaslatot, hogy a kölcsönhatások között az A, G, H helices a apomyoglobin fontos lehet az összecsukható beavatás (19), összhangban a kísérleti eredmények is gyanúba keveredett, ezek a régiók az egyensúlyi intermedierek a apomyoglobin (20), valamint a legkorábbi kinetikus lépéseket az összecsukható út (21). A myoglobin mutánsainak legújabb kísérleti tanulmányai (22, 23) meggyőző támogatást nyújtanak olyan modellekhez, amelyek hidrofób indítást és hajtogatást tartalmaznak.,
az Apomyoglobin paradigmává vált a hajtogatási utak kutatásában (24). Része a apomyoglobin molekula, amely az A, G, H helices része a B helix, redők gyorsan alkotnak egy-útvonal közbenső, a maradék a polipeptid lánc összecsukható lassabb ütemben, a rend másodperc (21, 25). A G és H spiráloknak megfelelő apomioglobin peptidfragmensei a spirális szerkezet hajlamát mutatták( 26-28), míg a fehérje többi részének megfelelő peptidek sokkal alacsonyabb hajlamot mutattak a hélixképződésre (29)., Mégis egy olyan kísérlet, amelyben a mioglobin h-hélixét mutálták, hogy csökkentsék a spirális hajlamát (30), nagyon kevés hatással volt a fehérje összecsukható sebességére. Sokkal nagyobb hatást figyeltek meg, amikor a disztális hisztidint (H64) fenilalaninra változtatták: az eltemetett poláris hisztidin nem poláris oldalláncának helyettesítése a hajtogatás arányának jelentős növekedését eredményezte (31). Ezek a vizsgálatok rámutattak az oldalláncos csomagolás fontosságára, különösen a helices érintkezési felületein, az apomyoglobin összecsukásának sebességére.,
az Apomyoglobin előnye, hogy egyensúlyban vizsgálható olyan megoldási körülmények között, amelyek megközelítik a kinetikus összecsukható út néhány megfigyelhető szakaszát. Így meg lehetett határozni a kibontott, részben hajtogatott apomioglobin megfelelőségét NMR-rel (32-35). Érdekes, hogy a sav-kibontakozott apomioglobin hajlamot mutat a nem natív spirális szerkezetre egy olyan régióban, amely összeköti a D és az E helikákat, valamint az A és H helikákban megfigyelt natív szerkezetre, amelyet a kinetikai vizsgálatokban jósoltak (34)., Az apomyoglobin különböző formáinak konformációs hajlamainak (32-35) NMR-vizsgálata magában foglalta a polipeptidlánc relaxációs paramétereinek meghatározását a helyszínre-kifejezetten meghatározza a gerinc dinamikáját a fehérje minden egyes állapotában. A hajtogatott fehérjékre alkalmas “modellmentes” analízis helyett a relaxációs adatokat a csökkentett spektrális sűrűségfüggvények j(0), J(wN) és J(wH) (36) kiszámításával elemeztük. A j(0) függvény µs–ms időléptékű mozgásokkal tájékoztat, és azt javasolja, hogy az apomioglobin pH-értéke 2 legyen.,3, az A és G hélixek átmeneti kapcsolatot létesítettek (34). Ez az izgalmas eredmény, amelyet később a spin-label NMR vizsgálatok (37) validáltak, végleges bizonyítékot szolgáltatott a natív-szerű hosszú távú kapcsolatokról egy kibontott fehérjében. Még érdekesebb, hogy a J(wN) függvény, amely a ps–ns időbeli mozgásáról tájékoztat, szekvencia-függő variációt mutatott, amely korrelálhat egy számított paraméter változásával, az “összecsukáskor eltemetett átlagos terület” (AABUF) (10)., Ez a paraméter, amely magában foglalja mind a szermaradék méretét, mind a hidrofobicitást, az egyes aminosavakra vonatkozik, de általában a szekvenciában öt-kilenc maradék ablakán átlagolják, és alternatív mennyiségi becslést nyújt a Matheson és Scheraga (3) által meghatározott hidrofobicitásról a képződés szabad energiája tekintetében. Abban az esetben, apomyoglobin pH 2,3, csúcsok a telek J (wN) vs., a szermaradék-szám, amely az NS alatti időbeli mozgás korlátozását jelzi, rendkívül jól megfelelt az AABUF-telken lévő csúcsoknak, amelyek a nagy és/vagy nempoláris aminosavak átlagosnál nagyobb számát jelzik. Ez a megfigyelés azt sugallta, hogy van egy minta az aminosavszekvenciában, amelyet a nagy és/vagy nempoláris oldalláncok csoportosítása határoz meg, mint a ref modellben. 3, ami a helyi hidrofób klaszterképződés által okozott polipeptid gerinc mozgásának korlátozásához vezet.
Apomyoglobin PH 2.,3 a megfigyelt NMR kémiai eltolódások (34) alapján az A és H spirálok spirális szerkezetére kis hajlandóságot mutat. Ezeket a hajlamokat 8 M karbamid (35) jelenlétében eltörlik, de a karbamid-denaturált apomoglobin relaxációs sebességének szekvenciafüggése érdekes korrelációt mutat az AABUF paraméterrel. Ebben az esetben a korreláció a J(wH) és az AABUF maxima közötti minimumok között van, ami arra utal, hogy a gerincmozgást az NS alatti időskálákon korlátozó helyi hidrofób kölcsönhatások még 8 M karbamidban is tartósak.,
annak a hipotézisnek a tesztelésére, miszerint az AABUF paraméter, azaz a hidrofobicitás felhasználható a polipeptidlánc összecsukható kezdő helyeinek előrejelzésére, egy specifikus apomioglobin mutációt készítettek (23). Az a spirál, amely részt vesz a kinetikus köztes, hogy az első alakult után összecsukható WT apomyoglobin, van egy sorrend, hogy ad okot, hogy legfeljebb a AABUF paraméter, mivel az E helix, amely valójában erősen hidrofób szerint a hagyományos helena, energy, idefics mérleg, meglehetősen alacsony AABUF egész hosszában., A hajtogatott apomyoglobinban a TRP-14 oldallánca az a spirálban az E helix gerincével szemben helyezkedik el a Gly-73-nál. Kettős mutáns mioglobin készült, amelyben a Trp-14 váltotta Glicin, valamint a Glicin-73 váltotta Trp. Indokolták, hogy a fehérje hajtogatott szerkezetét minimálisan meg kell zavarni ezzel a cserével, de az A és E helices AABUF paraméterét drasztikusan befolyásolni kell. A kérdés az volt, hogy az összecsukható utat is érinti-e. Valójában a mutáns összecsukása, amelyben a G73-at és a W14-et cserélik, más úton történik, mint a WT fehérje., Minden apomyoglobin variáns, amelyet eddig tanulmányoztak, egy spirális szerkezetet tartalmazó törtfázisú közbenső útján hajtogatható. A WT apomyoglobin esetében ez a közbenső tartalmazza az A, G és H helixeket (valamint a B helix egy részét). A G73-W14 swap mutánsban a köztes tartalmazza az E, G és H helixeket; az a helix nem védett a hajtogatás kezdeti szakaszában,hanem később hajtódik. Ez az eredmény (ábrán látható. 4) a WT proteinben megfigyelt A, G és H kapcsolatok helyett a mutánsban lévő E, G és H helices közötti kapcsolatot mutató spin-label vizsgálatok igazolták.,