Discovery of SmacCas9
, hogy módosítsa az ősi 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) Pam specificitását SpyCas9, a korai és a legújabb jelentések alkalmazott irányított evolúció (pl. “VQR”, “EQR”, “VRER”, és “Nrnh” változatok), illetve a kristályszerkezet (pl. “Qqr”, “Ng” és “nr” változatok)17,18,19,20,21,22. Ezek a jelentések az r1333 és R1335 Pam-vel érintkező argininmaradványokra összpontosítottak, amelyek kizárólagosan mutáció esetén megszüntetik a funkciót., Míg ezek a vizsgálatok kompenzációs mutációkat azonosítottak, amelyek megváltoztatták a Pam specificitást, az általuk előállított Cas9 változatok a Pam szekvencia legalább egy pozíciójában megőrizték a guanin preferenciát a jelentett in vivo szerkesztéshez. Az egyidejű jelentések evolúciós információkat használtak a Staphylococcus aureus Cas9 (sacas9) kanonikus 5\(^{\prime}\)-NNGRRT-3\(^{\prime}\) Pam specificitásának további lazítására,vagy alternatív 5\(^{\prime}\)-NNNNNCC-3\(^{\prime}\) Pam specificitás a kanonikus 5\(^{\prime}\)-NNNGHTT-3\(^{\prime}\) Pam a Neisseria meningitidis cas923, 24., A nukleázok mindkét új jelentések, azonban, még mindig inkább GC-tartalom legalább egy helyzetben a PAM szekvencia. Az ilyen GC-tartalom előfeltételeit egy egyedi bioinformatika-vezérelt munkafolyamaton keresztül kívántuk feloldani, amely a Streptococcus genus25 meglévő PAM sokféleségét aknázza ki. Ennek a stratégiának a felhasználásával a SmacCas9-en úgy viselkedtünk, mint amely képes megváltoztatni a nem GC Pam specificitást, amikor a SpyCas9 115 ortológját az UniProt-tól igazítottuk (azokra korlátozva, amelyek több mint 70% – os páronként BLOSSOM62 pontszám)., A nyomvonal találtunk SmacCas9 egyike volt a két közeli homológok, valamint a Streptococcus mutans b112sm-a Cas9 (SmutCas9), rendelkező glutaminok mindkét helyzetben igazodik az egyébként erősen konzervált Pam-érintkező argininek (ábra. 1a-b; kiegészítő ábra. 2A). Az argininmaradványokról ismert, hogy erősen kedvelik a guaninokat az aminosav-bázis interakciós tájban, amint azt a SpyCas9 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) specificitása is bizonyítja. A glutaminmaradványok viszont előnyben részesítik az adenineket, a fő horony szélével való kölcsönhatás révén. 26., Így feltételeztük, hogy a SmacCas9 természetesen koevolválta a szükséges kompenzációs mutációkat az új adeninben gazdag PAM-elismerés megszerzéséhez. A megfelelő Genom CRISPR tömbjének 13 távtartóból álló kis mintamérete megakadályozta, hogy magabiztosan következtetjünk a SmacCas9 Pam-ra silico-ban., Ennek ellenére a lehetőség SmacCas9 igénylő kevesebb GC-tartalom a PAM által támogatott szekvencia hasonlóság, hogy a “QQR” változat, amely már 5\(^{\miniszterelnök}\)-NAAG-3\(^{\miniszterelnök}\) specificity27, amellett, hogy a gazdag vélelmezett konszenzus PAM a fág-származó távtartók a CRISPR tömbök kapcsolódó fájlokat, homológ SmutCas9, amelyekről megállapították, hogy a támogatás a korábban leírt SPAMALOT csővezeték, összhangban a korábbi előrejelzések (Fig. 1C; kiegészítő ábra. 2b; kiegészítő ábra. 3) 25,28.
a SpyCas9, a QQR variáns és a SmacCas9 Szekvenciaigazítása. A piros vonal aláhúzásának lépése a SpyCas9 és a SmacCas9 összekapcsolását jelzi egy SpyMac hibrid felépítéséhez. A sorozat logója (Weblogo online tool) közvetlenül az igazítás alatt a spycas9 PAM-érintkező argininek körüli 11 pozícióban ábrázolja a megőrzést., b A SpyCas9 doménszervezete az RNS-vezérelt, célkötésű SpyCas9 (PDB ID 5F9R) színkódolt szerkezete felett helyezkedik el. A két DNS-szál fekete, kivéve a Pam-nek megfelelő bíbor szegmenst. Egy kék–zöld–piros szín térkép használt címke a Cas9 PI domain útmutató távtartó sorrend gomb megnyomásával jelölje ki a struktúrák biztosít sorozat sajátossága, valamint a prevalencia belüli domain kapcsolatok belül a PI43. c a szekvencia logo generált online (WebLogo), hogy volt bemenet a Pam szekvenciák talált Streptococcus fág kapcsolódó közeli SmacCas9 homologs.,
a SpyMac mérnöki és PAM jellemzése
empirikusan meghatároztuk több Streptococcus ortológus PAM preferenciáit, amelyek megváltoztatják az egyik vagy mindkét kritikus PAM-kapcsolatot. Alapján bizonyított példa a PAM-kölcsönhatás domain (PID), valamint útmutató RNS (gRNA), hogy a kereszt-kompatibilitást között Cas9 orthologs szorosan kapcsolódó, aktív, mi épített új változatok által racionálisan cseréje a PI régió, katalitikusan “halott” SpyCas9 (dSpyCas9) azokkal a kiválasztott orthologs (Kiegészítő Ábra., 2A-B) 29,30. Az összeszerelt variánsokat, köztük a dSpyMacCas9-et (a továbbiakban: dSpyMac), külön-külön E. coli sejtekké alakították át, valamint az S. pyogenes-ből származó vezető RNS-t és a Pam-SCANR genetikai áramkörben egy 8-mer PAM könyvtárat, amelyet leenay et al hozott létre.31. Az áramkör egy zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) szabályoz a PAM-kötő erő arányában. Ezért a GFP-pozitív sejtpopulációkat áramlási citometriával gyűjtöttük össze(kiegészítő ábra., 4) Sanger szekvenálta őket a Pam helyén, hogy meghatározzák a pozíció-bölcs bázis preferenciákat a megfelelő változat PAM felismerésében. dSpyMac, több, mint dSpyMutCas9, generált nyoma profil, amely leginkább összhangban guanin-független Pam felismerés, valamint a domináns specificitása adenin dinukleotidok (ábra. 2a; kiegészítő ábra. 2C).
egy olyan Kromatogram, amely a variáns-felismerő szekvenciák Pam-SCANR alapú dúsítását ábrázolja egy 5\(^{\prime}\)-NNNNNNNNNNNNNNNNNN-3\(^{\prime}\) könyvtárból. b SYBR-foltos agaróz gélek, amelyek In vitro 10 nM 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) szubsztrátokat mutatnak 16 perc inkubálás után 100 nM tisztított ribonukleoprotein enzimrendszerekkel. A nyilak megkülönböztetik a hasított termékek sávját a tisztítatlan hordozótól (felső sáv)., A mátrix-parcellák összefoglalják a hasított frakciószámításokat, amelyeket egy egyedi szkriptben hajtottak végre a gélképek feldolgozására. A mintákat független biológiai másolatokban végezték (n = 2). c az SmacCas9 és a SpyMac cél DNS-szubsztrát hasításának időmérése. d A DNS-szubsztrát hasítása a ribonukleoprotein 0,25:1, 1:1 és 4:1 mólarányának megfelelően a vad típusú SpyCas9 és a hibrid SpyMac célpontja. A forrásadatok Forrásadatfájlként vannak megadva.,
ezután megtisztítottuk a nukleáz-aktív enzimeket, hogy tovább vizsgáljuk a DNS célfelismerési potenciálját és a SpyMac egyediségét. (Kiegészítő Ábra. 5A) 27,32. Külön-külön inkubáltuk a ribonukleoprotein komplex enzimeket (Cas9 + crRNA + tracrRNA) mind az 5\(^{\prime) kettős szálú cél szubsztrátokkal}\)/3\(^{\prím}\) – szomszédos báziskombinációk egy adenin dinukleotid Pam (5\(^{\prime}\) – NAAN-3\(^{\prime}\); ábra. 2b)., Egy rövid 16 perces emésztés mind a vad típusú SmacCas9, mind a hibrid SpyMac 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) melletti hasadást jelezte szélesebb körben és egyenletesen, mint a korábban bejelentett QQR változat. A SpyMac tovább különböztette meg magát a gyors DNS-vágási sebességekkel, amelyek hasonlítanak a SpyCas9 gyorsan emészthető kinetikájára (ábra. 2c-d–33. Olyan reakciókat futtattunk, amelyek különböző crRNA-távtartókat és tracrna-szekvenciákat használtak, mivel ez utóbbi kissé eltér az S. macacae és az S. pyogenes genomoktól (kiegészítő ábra). 5B-E–., E két paraméter egyike sem kompenzálta a SmacCas9 lassabb hasadási sebességét, de észrevettük a vad típusú forma aktivitásának marginális javulását a natív tracrRNA-val, amely a guide-Cas9 interakció interfészével társul, amely többnyire a PI domainen kívül esik.
genomszerkesztés iSpyMac
a CRISPResso2 indel analízis az erősített genomiális régiók NGS-jét követve, hogy felmérjék az iSpyMac célirányú szerkesztését a SpyMac-hoz és a SpyCas9-hez képest, a jelzett 5\(^{\prime}\)-naa-3\(^{\prime}\) és 5\(^{\prime}\) – NGG-3\(^{\Prime}\) Pam szekvenciák. A mintákat két független transzfekciós replikátumban végezték (n = 2). b hatékonyság hőtérkép eltérés tolerancia vizsgálat genomi célok., A TIDE algoritmus41 által értékelt számszerűsített indel-frekvenciákat a jelzett Cas9 változat sgRNA-sorrendjében minden egyes címkézett egy-vagy kettős eltérés esetén kiállítják, és feltüntetik a Pam-szekvenciát. A mintákat két független transzfekciós replikátumban végezték (n = 2). c CRISPResso2 genomikus bázisszerkesztő elemzés a genomikus ampliconok NGS-jét követően a citozinok timinokká történő átalakításának az iSpyMac-BE3 általi értékelésére. A mintákat két független transzfekciós replikátumban végezték (n = 2). Az összes forrásadat Forrásadatfájlként van megadva.,
a Következő értékeltük, a tolerancia, a iSpyMac, hogy másféle, sorozatok, alkalmazásával sgRNAs menedéket dupla vagy egyetlen eltérés, hogy egy fix protospacer belül a AAVS gén, aki 5\(^{\miniszterelnök}\)-GAAG-3\(^{\miniszterelnök}\), PAM sorozat. az iSpyMac az sgRNA Pam-proximális szegmensében egyetlen eltéréssel rendelkező célok szerkesztési képességeit mutatta be., Enyhíteni ezt kellene off-target hajlandóság, bevezettük a R691A mutáció, amely korábban elszigetelt keresztül bakteriális szelekció SpyCas9, hogy fenntartsa a magas célzott tevékenység, miközben csökkenti off-target editing35. A high-fidelity változat, HiFi-iSpyMac, kiállított szinte elhanyagolható tevékenység felemás sorozatok, mint az eredeti enzim, minimális veszteséggel a célzott tevékenység (Fig. 3b).,
Végül kiválasztott egy ablak a négy nukleotid VEGFA locus egy sorozat összefüggésben olyan, hogy bármely más CRISPR endonuclease a bejelentett használni alap szerkesztési nem teszi lehetővé az alap szerkesztési egy citidin-deamináz-olvasztott enzyme36. Ennek megfelelően COTRANSFECTED HEK293T sejtek egy nickáz formában iSpyMac származó korábban bejelentett BE3 architektúra citozin bázis szerkesztése (iSpyMac-BE3) és az sgRNA plazmid célzó Pam downstream a kiválasztott nukleotidok5., Hatékony bázisszerkesztési szinteket mértünk a betakarított sejtekben, amelyek több mint 20% citozin-timin konverziót mutattak ezeken a pozíciókon NGS analízis útján (ábra. 3c).