Grenzen in der Veterinärwissenschaft

Einführung

Wirbellose Tiere umfassen etwa eine Million Tierarten, die sowohl in zoologischen Einrichtungen als auch in Haushalten gehalten werden, in denen sie als exotische Haustiere von Hand aufgezogen werden (1). Gastropoden umfassen fast 60.000 Arten von Wasser-und Landmollusken, hauptsächlich Schnecken und Schnecken (1). Die riesige afrikanische Landschnecke (Achatina fulica, syn., Lissachatina fulica) stammt aus Ostafrika, ist jedoch eine weit verbreitete invasive Art in Asien, Ozeanien und in jüngerer Zeit in Amerika, wo sie versehentlich oder gezielt als Nahrungsquelle und als Haustier eingeführt wurde. Seine Freisetzung in natürliche Ökosysteme, landwirtschaftliche und städtische Gebiete hat zu ökologischen, gesundheitlichen und landwirtschaftlichen Bedrohungen geführt (2, 3). Die riesige afrikanische Landschnecke ist ein Zwischenwirt für mehrere Parasiten, darunter Aelurostrongylus abstrusus, Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus costaricensis, Schistosoma mansoni, Hymenolepis spp., und Fasciola hepatica (4, 5). Alle oben genannten Helminthen, mit Ausnahme von A. abstrusus, können beim Menschen schwere Krankheiten verursachen. Insbesondere ist die riesige afrikanische Landschnecke die Hauptschnecke, die für die weltweite Ausbreitung von A. cantonensis verantwortlich ist, die in Asien und Amerika eine humane eosinophile Meningoenzephalitis verursacht (2, 6). Risikofaktoren für eine Infektion bei Menschen, Haustieren und Wildtieren mit diesen Helminthenparasiten sind die Einnahme von rohen oder ungekochten infizierten Schnecken oder Schnecken oder Lebensmitteln, die durch den Schleim infizierter Schnecken oder Schnecken kontaminiert sind (4, 5, 7, 8).,

Obwohl die afrikanischen Riesenlandschnecken zu den beliebtesten Schnecken gehören, die als Haustiere gehalten werden, und ihre weltweite Popularität als exotische Haustiere schnell zunimmt, wurden nur wenige Umfragen zum Auftreten ihrer Parasiten unter natürlichen Bedingungen durchgeführt (2, 6, 9-11). Ziel dieser Untersuchung war es, das Auftreten von Parasiten in afrikanischen Riesenschnecken zu untersuchen, die in Süditalien als Haustiere gezüchtet wurden.,

Materialien und Methoden

Allgemeine Daten

Im August 2018 wurden drei Pools frischer Stuhlproben aus insgesamt 60 afrikanischen Riesenschnecken, die in drei verschiedenen Privatsammlungen in Pozzuoli, Caserta und Neapel (Italien) aufbewahrt wurden, auf Parasiten untersucht. Von jedem Ort erhielten wir einen Kot-Pool von jeweils 20 einzelnen Schnecken. Die in diese Umfrage einbezogenen Schnecken hatten ein Durchschnittsalter von 1, 6 Jahren zwischen 0, 2 und 2 Jahren und hatten keine vorherige antiparasitäre Behandlung erhalten., Schnecken gefüttert wurden, frisches Gemüse und Obst; außerdem eine calcium-supplementation (Kalzium, Exo Terra, Hagen Deutschland GmbH & Co. KG, Holm, Deutschland) zweimal pro Woche zur Verfügung gestellt. Alle Tiere wurden in Italien in Privatbesitz gezüchtet und als Haustiere in vier Indoor-Terrarien von 60 × 30 × 45 cm Größe in Gruppen von 10-20 Tieren gehalten (2 Gruppen von 20 Schnecken in Pozzuoli und Caserta und 2 Gruppen von je 10 Schnecken in Neapel)., Als Substrat wurde ein organischer Torfboden (Organic Coco-Torfboden, E-Coco Products, Gloucestershire, UK) verwendet, der zuvor wärmebehandelt (100°C für 30 min) und dann frei von Parasiten und Insekten war.

Diagnoseverfahren

Aus jedem der vier Terrarien wurden zunächst zwanzig Gramm frischer Kot gewonnen., Wenn gepoolter Kot, der durch frischen Abstrich analysiert wurde, Flotation und Baermann-Test zeigten eine positive Reaktion auf Rhabditidnematoden, Zwei Schnecken aus jedem positiven Terrarium wurden einzeln in einer sterilen Plastikbox untergebracht, und ihr Kot wurde unmittelbar nach der Defäkation in einem sterilen 50-ml-Plastikschlauch gesammelt. Die koprologische Untersuchung für gepoolte und einzelne Proben umfasste frischen Abstrich, Zentrifugalflotation (2 g Kot für jeden Test) unter Verwendung einer Lösung von Zucker und Formaldehyd (spezifisches Gewicht 1,27) und Baermann-Test (10 g Kot für jeden Test)., Zusätzlich wurde der bei der Abstrichuntersuchung erhaltene Schleim unter einem Lichtmikroskop analysiert. Da die Larvenformen mehrerer Helminthenarten in den Fußmuskel von Schnecken eindringen können, wurde die histologische Untersuchung von Biopsieproben aus dem vorderen und hinteren Bereich des Fußmuskels in 30 Schnecken durchgeführt, die mit der von Giannelli et al. (12) und Gilbertson und Wyatt (13)., Die Biopsieproben wurden in 10% neutralem phosphatgepuffertem Formalin fixiert und routinemäßig zu Paraffinblöcken verarbeitet, die in 3 µm dicke Abschnitte geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt wurden. Die Studie wurde unter Genehmigung der Praxis durchgeführt, in der sie stattfand, und unter unterschriebener schriftlicher Zustimmung des informierten Eigentümers.

Morphologische Identifizierung

Temporäre Halterungen wurden durch wärmeabtötende Nematoden auf Glasschieber in einem Wassertropfen hergestellt, wonach ein Glasdeckelschlupf angelegt wurde., Nematoden wurden in einen Tropfen Leitungswasser auf einem Glasschieber überführt und 10 s lang auf eine Heizung (100°C) gestellt. Zur Beobachtung wurden ein Amplivallichtmikroskop, Carl Zeiss Jena, und ein Leitz Diaplan mit Nomarski Optik verwendet., Die morphologische Identifizierung von Rhabditidnematoden folgte Andrassy (14) und Andrassy (15) und basierte hauptsächlich auf der Morphologie von Pharynx und Stoma und dem Fortpflanzungssystem, hauptsächlich den Merkmalen von Spicules, Anzahl und Position von Papillen oder Vorhandensein und Größe oder Form von Bursa für Männer; und Schwanzform, Position der Vulva und Morphologie des Fortpflanzungssystems für Frauen. Die Identifizierung der Larven basierte auf der Schwanzform.

Molekulare Analyse

DNA wurde aus Nematodenproben extrahiert, die aus Fäkalien gewonnen wurden, die in 96% Ethanol fixiert waren, das von den drei Orten gesammelt wurde., Nematoden wurden vor der molekularen Analyse über Nacht in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) gewaschen, um Reste von Ethanol vollständig zu entfernen. Jeder einzelne Nematode wurde in ein steriles Eppendorf-Röhrchen (200 µl) mit 20 µl Extraktionspuffer (17,7 µl ddH2O, 2 µl 10 × konzentrierter PCR-Puffer, 0,2 µl 1% Tween 20 und 0,1 µl Proteinase K) überführt. Puffer und Nematoden wurden bei -20°C für 20 min eingefroren und dann sofort bei 65°C für 1 h inkubiert, gefolgt von 10 min bei 95°C., Die Lysate wurden auf Eis gekühlt und dann zentrifugiert (2 min, 9.000 g); 1 µl Überstand wurde für die PCR verwendet.

Ein Fragment von rDNA, das die internen transkribierten Spacerregionen (ITS1, 5.8 S, ITS2) enthält, wurde unter Verwendung der Primer 18S: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′ (vorwärts) und 28S: 5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′ (rückwärts) (16) verstärkt. Ein rDNA-Fragment, das das Gen für 18S-rRNA enthielt, wurde unter Verwendung der Primer 22F: 5′- TCC AAG GAA GGC AGC AG GC-3′ (vorwärts) und 1080JR: 5′- TCC TGG TGG TGC CCT TCC GTC AAT TTC-3′ (rückwärts) amplifiziert (17). Der PCR Master Mix bestand aus: ddH2O, 7.,25µl; 10 × PCR-Puffer, 1,25 µl; Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs), 1 µl; 0,75 µl sowohl Vorwärts-als auch Rückwärts-Primer; Polymerase, 0,1 µl; und 1 µl DNA-Extrakt. Die PCR-Profile wurden wie folgt verwendet: für einen Zyklus von 94°C für 7 min, gefolgt von 35 Zyklen von 94°C für 60 s, 50°C für 60 s und 72°C für 60 s und einer Enddehnung bei 72°C für 7 min (14); für 18S 1 Zyklus von 94°C für 5 min, gefolgt von 35 Zyklen von 94°C für 60 s, 55°C für 90 s und 72°C für 2 min und einer Enddehnung bei 72°C für 10 min., Die PCR-Produkte wurden von GATC Biotech (Deutschland) sequenziert und später bearbeitet und in die GenBank hochgeladen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

Ergebnisse

Der Baermann-Test ergab in allen Proben Nematodenlarven mit einer Länge von 170 bis 336 µm. Eier, Larven und adulte Rhabditidnematoden wurden durch frische Abstrich-und Flotationsmethoden in allen Stuhlproben nachgewiesen. Rhabditella axei (Abbildung 1) wurde morphologisch aus zwei von drei gepoolten und einzelnen Stuhlproben aus Pozzuoli und Neapel identifiziert. Darüber hinaus Rhabditis terricola, Cruznema sp.,, und Pristionchus entomophagus wurden aus einem Pool und einzelne fäkale Proben aus Caserta isoliert. In den Muskelbiopsieproben oder im Schleim wurden keine Parasiten nachgewiesen.

Mehrere morphologische Arten von Rhabditidnematoden wurden aus in 96% Ethanol fixiertem Schneckenkot isoliert. Erhaltene und bearbeitete Sequenzen von ITS und 18S dieser Nematoden wurden (BLAST) mit dem Material in GenBank verglichen und als R. axei identifiziert (partielle 18S, Beitrittsnummer MK124578, Ähnlichkeit 99%), Rh., terricola (partielle 18S und partielle ITS1, Beitrittsnummer MK156052, Ähnlichkeit 100%), P. Entomophagus (partielle 18S und partielle ITS1, Beitrittsnummer MK156050, Ähnlichkeit 99%) und Cruznema sp. (partielle 18S und partielle ITS1, Beitrittsnummer MK156051, Ähnlichkeit 96-100%).

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass alle untersuchten afrikanischen Riesenschnecken Eier, Larven und adulte Rhabditidnematoden im Kot legen und daher eine Infektionsquelle für andere Haustiere und Menschen darstellen können. Um eine falsche Identifizierung mit Strongyloides sp zu vermeiden.,, eine Nematodenart, die eine enge Ähnlichkeit mit Rhabditiden aufweist, die eine klare parasitäre zoonotische Relevanz hat (14, 15, 18), Die anfängliche morphologische Diagnose von Rhabditidnematoden wurde durch molekulare Analysen bestätigt.

Rhabditidae umfassen freilebende saprophytische Nematoden, die häufig in Böden und organischen Ablagerungen vorkommen und sich hauptsächlich von Bakterien ernähren. Viele Schneckenarten können als endgültige Wirte für Rhabditidnematoden dienen (14, 15). Eine Reihe von Rhabditis-und Rhabditella-Arten wurde jedoch mit Wirbeltieren in Verbindung gebracht, einschließlich Menschen (14, 15, 19-27)., Obwohl ihre Anwesenheit das Ergebnis einer Umweltverschmutzung sein kann, können diese Nematoden bei vielen Tieren und Menschen Krankheiten verursachen. Rhabditis elongata, Rh. hominis, und Rh. usuii-Larven wurden aus menschlichen Fäkalien, Urin und Vaginalabstrichen isoliert (19-21). Nichtsdestotrotz wurden beim Menschen nicht viele Fälle von symptomatischen Infektionen berichtet (21-24). Feng und Li (25) beschrieben zwei menschliche Fälle von Harnwegsinfektionen von R. axei in China und Ahn et al. (20) berichtete über fünf Fälle von Darminfektionen beim Menschen mit Rhabditis sp. in ländlichen Schulkindern Südkoreas., In ähnlicher Weise wurden in China zwei Fälle von Darminfektionen beim Menschen durch R. axei beschrieben (26), während in einer anderen veröffentlichten Arbeit (21) von einer Darminfektion bei einem 5 Monate alten brasilianischen Kind berichtet wurde, bei dem Fieber sowie wässriger und blutiger Durchfall auftraten; Die koprologische Untersuchung ergab Eier, Larven und Erwachsene von Rhabditis sp. Meamar et al. (27) beschrieb das Auftreten von wässrigem Durchfall bei zwei iranischen AIDS-Patienten, die mit einer schweren Darminfektion durch Larven und erwachsene Exemplare von R. axei in Verbindung gebracht wurden. Schließlich, Teschner et al., (24) kürzlich wurde ein Fall von Außenohrkanalinfektion bei einem 37-jährigen Mann beschrieben, bei dem eitrige Otorrhoe aus beiden Ohren und akuter Hörverlust durch Rhabditis sp auftraten. Im Allgemeinen, Rhabditis spp. werden als häufige Ursache für äußere Otitis bei Rindern angesehen, die in tropischen Gebieten (z. B. Südamerika und Afrika) leben, insbesondere bei älteren Tieren, und wurden auch bei Hühnern, Hunden und Schweinen mit unverträglichem Durchfall identifiziert (18, 28-30). Es wurden jedoch auch asymptomatische Infektionen beschrieben, und diese Nematoden werden oft als Pseudoparasiten betrachtet (28, 29).,

Obwohl in allen fäkalen Proben frei lebende Nematoden gefunden wurden, wurden in den Schleim-und histologischen Proben keine Proben gefunden. Eine mögliche Erklärung für diesen Befund ist, dass Nematoden in verschiedenen Geweben/Organen ihrer Wirte lokalisieren können, abhängig von der Art der Assoziation Nematoden/Molluskenwirt (15, 31, 32). Rhabditis spp. vervollständige seinen Lebenszyklus innerhalb der Schnecke, ohne Schaden an seinem Molluskenwirt. Frühere Studien zu den Freiland – afrikanischen Schnecken (Archachatina spp. und Achatina spp.) zeigten, dass R., axei lebt im Magen-Darm-Trakt seines Schneckenwirts, wo der gesamte Lebenszyklus des Nematoden abgeschlossen ist (31-33).

Obwohl afrikanische Riesenschnecken als Wirte für R. axei aufgeführt sind, war das Auftreten dieses Nematoden nur bei einigen Arten afrikanischer Riesenschnecken außer A. fulica, nämlich Archachatina marginata ovum, Ar, berichtet worden. marginata saturalis, und Achatina achatina (31). Andererseits hat P. entomophagus eine weltweite Verbreitung und wurde hauptsächlich mit Mistkäfern in Verbindung gebracht, die zur Superfamilie Scarabaeoidea gehören (34, 35), R., terricola wurde in Salamander (14, 15) und Cruznema spp. in der cricket-Gryllodes laplatae (orthopteren) (36). In allen Fällen erfolgt die Übertragung des Parasiten durch den Kontakt der Schnecken mit kontaminiertem feuchtem Boden, der reich an zersetzendem organischem Material ist (31, 37). Obwohl in den vorliegenden Fällen alle Tiere in Terrarien mit einem wärmebehandelten organischen Boden gehalten wurden, spekulieren wir, dass eine Infektion vor dem Kauf der Tiere in den Zoohandlungen oder Zuchtanlagen aufgetreten sein könnte.,

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die afrikanischen Landschnecken als Reservoir für mehrere Rhabditidnematoden dienen können. Diese Schneckenart gehört zu den am häufigsten als Haustiere gehaltenen und lebt daher oft in unmittelbarer Nähe zum Menschen. Infolgedessen ist die Kontamination der häuslichen Umgebung durch ihren Kot möglich. Obwohl parasitäre Nematoden in dieser Studie nicht isoliert wurden, sollten die riesigen afrikanischen Landschnecken immer noch als potenzielle Träger von Nematoden angesehen werden, die opportunistische Krankheiten beim Menschen verursachen können., Daher unterstreichen wir die Bedeutung weiterer epidemiologischer Untersuchungen zum Auftreten freilebender und parasitärer Nematoden in Gastropodenschnecken, die in Gefangenschaft gehalten werden, und betonen die Notwendigkeit strenger Kontrollmaßnahmen, um das Risiko einer opportunistischen Infektion mit Rhabditidnematoden bei Haustierschneckenbesitzern zu verringern.

Autorenbeiträge

Dd ‚ O und MS konzipierten und planten die Analyse. MS und JN führten die Analyse durch. CA hat die Forschung mitgestaltet und das Manuskript bearbeitet. Alle Autoren gaben kritisches Feedback und trugen zum endgültigen Manuskript bei.,

Interessenkonflikterklärung

Die Autoren erklären, dass die Untersuchung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

13. Gilbertson CR, Wyatt JD. Bewertung von Euthanasie-Techniken für eine wirbellose Art, Landschnecken (Succinea putris). J Am Assoc Lab Anim Sci. (2016) 55:577–81.,

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