Gelelektrophorese Definition
Gelelektrophorese ist ein Verfahren zur Trennung biologischer Moleküle nach Größe. Die Trennung dieser Moleküle wird erreicht, indem sie in ein Gel mit kleinen Poren gegeben werden und ein elektrisches Feld über das Gel erzeugt wird. Die Moleküle bewegen sich aufgrund ihrer Größe und elektrischen Ladung schneller oder langsamer.,
Gelelektrophorese Übersicht
Der Prozess der Gelelektrophorese funktioniert, weil sich negativ geladene Moleküle vom negativen Pol des elektrischen Stroms entfernen und sich kleinere Moleküle schneller bewegen als größere Moleküle. Somit wird eine Größentrennung innerhalb des Molekülpools erreicht, der durch das Gel läuft. Das Gel arbeitet ähnlich wie ein Sieb, das Partikel nach Größe trennt. Die Elektrophorese arbeitet, um die Partikel unter Verwendung ihrer inhärenten elektrischen Ladung durch das Sieb zu bewegen.,
Wenn Forscher beispielsweise versuchen, zwischen verschiedenen DNA-Segmenten zu unterscheiden, ist der Vorgang einfach. Die Proben werden zu Beginn des Gels in Kanäle geladen. Jedes DNA-Molekül hat die gleiche Ladung (-1), da DNA von denselben 4 Nukleotiden gebildet wird und unabhängig von seiner Größe immer eine leicht negative Ladung trägt. Daher hat jedes DNA-Molekül die gleiche Kraft, die es durch das Gel zieht.
Die Größe jedes Moleküls behindert jedoch seinen Fortschritt durch das Gel., Große Moleküle treffen Teile der Gelmatrix und werden verlangsamt. Kleine DNA-Moleküle können zwischen den verschiedenen Komponenten der Gelmatrix gleiten und schnell auf die andere Seite des Gels gelangen. Nach einer gewissen Zeit können die gefärbten DNA-Moleküle in verschiedenen Bereichen des Gels aggregiert werden, basierend darauf, wie weit sie sich während der Gelelektrophorese bewegten. Auf diese Weise können Forscher die Segmente identifizieren und die DNA verschiedener Organismen vergleichen.
Wofür wird Gelelektrophorese verwendet?,
Der Zweck der Gelelektrophorese besteht darin, Moleküle zu visualisieren, zu identifizieren und zu unterscheiden, die mit einer früheren Methode wie PCR, enzymatischer Verdauung oder einem experimentellen Zustand verarbeitet wurden. Häufig werden Mischungen von Nukleinsäuren oder Proteinen, die aus einem früheren Experiment/Verfahren gesammelt wurden, durch Gelelektrophorese geführt, um die Identität zu bestimmen oder zwischen Molekülen zu unterscheiden.,
Gelelektrophorese-Schritte
Die großen Schritte eines gemeinsamen DNA-Gelelektrophorese-Protokolls:
Probenvorbereitung
Die DNA wird isoliert und vorverarbeitet (z. B. PCR, enzymatische Verdauung) und in Lösung mit einem grundlegenden blauen Farbstoff hergestellt, um die Bewegung der Probe durch das Gel zu visualisieren.
Es wird eine Agarose-TAE-Gellösung hergestellt
TAE-Puffer liefert eine Ionenquelle zum Aufbau des elektrischen Feldes während der Elektrophorese., Zur Herstellung der Lösung wird die Gewichts-Volumen-Konzentration von Agarose im TAE-Puffer verwendet. Wenn beispielsweise ein 1% iges Agarosegel benötigt wird, wird 1 g Agarose zu 100 ml TAE gegeben. Der verwendete Agaroseprozentsatz wird dadurch bestimmt, wie groß oder klein die DNA sein soll. Wenn man einen Pool kleinerer DNA-Bänder (<500bp) trennt, wird ein höheres prozentuales Agarosegel (>1%) hergestellt. Der höhere Anteil an Agarose erzeugt ein dichteres Sieb, um die Trennung kleiner DNA-Längenunterschiede zu erhöhen., Die Agarose-TAE-Lösung wird erhitzt, um die Agarose aufzulösen.
Gießen des Gels
Die Agarose-TAE-Lösung wird in eine Gießschale gegossen, die nach dem Abkühlen und Erstarren der Gellösung eine Gelplatte mit einer Reihe von Vertiefungen oben bildet.
Einrichten der Elektrophoresekammer
Das feste Gel wird in eine mit TAE-Puffer gefüllte Kammer gegeben. Das Gel ist so positioniert, dass die Kammerschächte der negativen Elektrode der Kammer am nächsten sind.,
Beladen des Gels
Die Gelkammerschächte werden mit den DNA-Proben beladen und üblicherweise wird auch eine DNA-Leiter als Referenz für Größen geladen.
Elektrophorese
Die negativen und positiven Leitungen sind an die Kammer und an ein Netzteil angeschlossen, wo die Spannung eingestellt ist. Das Einschalten der Stromversorgung richtet das elektrische Feld ein und die negativ geladenen DNA-Proben beginnen durch das Gel und weg von der negativen Elektrode zum Positiven zu wandern.,
Stoppen der Elektrophorese und Visualisierung der DNA
Sobald der blaue Farbstoff in den DNA-Proben weit genug durch das Gel gewandert ist, wird die Stromversorgung ausgeschaltet und das Gel entfernt und in eine Ethidiumbromidlösung gegeben. Ethidiumbromid interkaliert zwischen DNA und ist im UV-Licht sichtbar. Manchmal wird Ethidiumbromid in Schritt 2 direkt zu der Agarosegellösung gegeben. Das mit Ethidiumbromid gefärbte Gel wird dann UV-Licht ausgesetzt und ein Bild aufgenommen. DNA-Bänder werden von jeder Spur entsprechend einer Kammer gut visualisiert., Die DNA-Leiter, die geladen wurde, wird ebenfalls visualisiert und die Länge der DNA-Bänder kann geschätzt werden. Ein Beispiel ist in der folgenden Abbildung angegeben.
Gelelektrophorese
Es gibt zwei Arten von Gelelektrophorese: native und Denaturierung. Native Gelelektrophorese versucht normalerweise, RNA oder Protein in seiner nativen Struktur zu halten, während es durch das Gel läuft., Die denaturierende Gelelektrophorese versucht, die RNA oder das Protein vor oder während der Gelelektrophorese in seine linearste Struktur zu reduzieren.
Die Denaturierung der RNA oder des Proteins erfolgt durch Zugabe eines Reduktionsmittels zu Probe, Gel und / oder Puffer. Das Reduktionsmittel trennt Bindungen innerhalb der RNA oder des Proteinmoleküls und reduziert dadurch seine Sekundärstruktur. Die Sekundärstruktur eines Proteins oder einer RNA beeinflusst auf nichtlineare Weise, wie schnell es durch ein Gel wandert., Eine denaturierte, lineare Form von RNA oder Protein wandert jedoch proportional zu seiner linearen Größe (Basenpaare oder Kilo-Daltons). Die denaturierende Gelelektrophorese ist häufig genauer zur Größenidentifikation, während die native Gelelektrophorese üblicherweise zur Identifizierung größerer Proteinkomplexe verwendet wird.
Beispiele für Gelelektrophorese
- TAE-Agarose-Gelelektrophorese wird am häufigsten für DNA verwendet.
- TBE und Denaturierungsseite (Polyacrylamidgelelektrophorese) sind für die RNA-Trennung üblich.,
- SDS PAGE ist eine denaturierende Gelelektrophorese, die üblicherweise zur Proteinidentifikation und-trennung verwendet wird.