électrophorèse sur Gel définition
l’électrophorèse sur Gel est une procédure utilisée pour séparer les molécules biologiques par taille. La séparation de ces molécules est obtenue en les plaçant dans un gel avec de petits pores et en créant un champ électrique à travers le gel. Les molécules se déplaceront plus rapidement ou plus lentement en fonction de leur taille et de leur charge électrique.,
vue d’ensemble de L’électrophorèse sur Gel
le processus d’électrophorèse sur gel fonctionne parce que les molécules chargées négativement s’éloignent du pôle négatif du courant électrique et que les molécules plus petites se déplacent plus rapidement que les molécules plus grandes. Ainsi, une séparation de taille est obtenue dans le pool de molécules traversant le gel. Le gel fonctionne de manière similaire à un tamis séparant les particules par taille. L’électrophorèse fonctionne pour déplacer les particules, en utilisant leur charge électrique inhérente, à travers le tamis.,
lorsque les chercheurs tentent de distinguer différents segments d’ADN, par exemple, le processus est simple. Les échantillons sont chargés dans des canaux au début du gel. Chaque molécule D’ADN a la même charge (-1), car L’ADN est formé par les mêmes 4 nucléotides et porte toujours une charge légèrement négative quelle que soit sa taille. Par conséquent, chaque molécule D’ADN aura la même force la tirant à travers le gel.
cependant, la taille de chaque molécule entrave sa progression dans le gel., Les grosses molécules frappent des parties de la matrice de gel et sont ralenties. De petites molécules D’ADN peuvent se glisser entre les différents composants de la matrice de gel et se frayer un chemin rapidement vers l’autre côté du gel. Après un certain temps, on peut voir les molécules d’ADN teintées s’agréger dans différentes zones du gel, en fonction de la distance qu’elles ont parcourue pendant l’électrophorèse sur gel. Cela permet aux chercheurs d’identifier les segments et de comparer l’ADN de différents organismes.
dans quel cas L’électrophorèse sur Gel est-elle utilisée?,
le but de l’électrophorèse sur gel est de visualiser, d’identifier et de distinguer les molécules qui ont été traitées par une méthode antérieure telle que la PCR, la digestion enzymatique ou une condition expérimentale. Souvent, des mélanges d’acides nucléiques ou de protéines collectés à partir d’une expérience/méthode précédente sont soumis à une électrophorèse sur gel pour déterminer l’identité ou différencier les molécules.,
étapes D’électrophorèse sur GEL
Les grandes étapes impliquées dans un protocole commun D’électrophorèse sur GEL D’ADN:
préparation des échantillons pour l’exécution
l’ADN est isolé et prétraité (par exemple PCR, digestion enzymatique) et constitué en solution avec colorant pour aider à visualiser le mouvement de L’échantillon à travers le gel.
une solution de gel d’agarose TAE est préparée
le tampon TAE fournit une source d’ions pour la mise en place du champ électrique pendant l’électrophorèse., La concentration poids / volume d’agarose dans le tampon TAE est utilisée pour préparer la solution. Par exemple, si un gel d’agarose à 1% est requis, 1 g d’agarose est ajouté à 100 ml de TAE. Le pourcentage d’agarose utilisé est déterminé par la taille ou la taille de l’ADN. Si l’on cherche à séparer un pool de bandes D’ADN de plus petite taille (<500bp), un pourcentage plus élevé de gel d’agarose (>1%) est préparé. Le pourcentage plus élevé d’agarose crée un tamis plus dense pour augmenter la séparation des petites différences de longueur D’ADN., La solution d’agarose-TAE est chauffée pour dissoudre l’agarose.
coulée du gel
la solution d’agarose TAE est versée dans un plateau de coulée qui, une fois la solution de gel refroidie et solidifiée, crée une dalle de gel avec une rangée de puits en haut.
mise en place de la chambre d’électrophorèse
le gel solide est placé dans une chambre remplie de tampon TAE. Le gel est positionné de manière à ce que les puits de la chambre soient les plus proches de l’électrode négative de la chambre.,
chargement du gel
Les puits de la chambre de gel sont chargés avec les échantillons D’ADN et généralement, une échelle D’ADN est également chargée comme référence pour les tailles.
électrophorèse
Les fils négatifs et positifs sont connectés à la chambre et à une alimentation où la tension est réglée. Allumer l’alimentation installe le champ électrique et les échantillons d’ADN chargés négativement commenceront à migrer à travers le gel et à s’éloigner de l’électrode négative vers le positif.,
arrêt de l’électrophorèse et visualisation de l’ADN
Une fois que le colorant bleu dans les échantillons D’ADN a migré suffisamment loin dans le gel, l’alimentation est coupée et le gel est retiré et placé dans une solution de bromure d’éthidium. Le bromure d’éthidium s’intercale entre L’ADN et est visible à la lumière UV. Parfois, le bromure d’éthidium est ajouté directement à la solution de gel d’agarose à l’étape 2. Le gel coloré au bromure d’éthidium est ensuite exposé à la lumière UV et une photo est prise. Les bandes D’ADN sont visualisées à partir de chaque voie correspondant à un puits de chambre., L’échelle D’ADN chargée est également visualisée et la longueur des bandes D’ADN peut être estimée. Un exemple est donné dans la figure ci-dessous.
Types d’Électrophorèse en Gel
Il existe deux types de gel d’électrophorèse: native et de dénaturation. L’électrophorèse sur gel natif tente généralement de maintenir L’ARN ou la protéine dans sa structure native tout en l’exécutant à travers le gel., L’électrophorèse sur gel dénaturant tente de réduire l’ARN ou la protéine dans sa structure la plus linéaire avant ou pendant l’électrophorèse sur gel.
la dénaturation de L’ARN ou de la protéine est réalisée en ajoutant un agent réducteur à l’échantillon, au gel et/ou au tampon. L’agent réducteur sépare les liaisons à l’intérieur de L’ARN ou de la molécule de protéine et réduit ainsi sa structure secondaire. La structure secondaire d’une protéine ou D’un ARN influencera, de manière non linéaire, la vitesse à laquelle elle migre à travers un gel., Une forme linéaire dénaturée D’ARN ou de protéine, cependant, migrera proportionnellement à sa taille linéaire (paires de bases ou Kilo Daltons). L’électrophorèse sur gel dénaturant est souvent plus précise pour l’identification de la taille, alors que l’électrophorèse sur gel natif est généralement utilisée pour identifier des complexes protéiques plus importants.
exemples D’électrophorèse sur Gel
- L’électrophorèse sur Gel D’Agarose TAE est la plus couramment utilisée pour L’ADN.
- TBE et page de dénaturation (électrophorèse sur gel de polyacrylamide) sont courants pour la séparation de L’ARN.,
- SDS PAGE est une électrophorèse sur gel dénaturant couramment utilisée pour l’identification et la séparation des protéines.