vérification expérimentale des modèles
La première approche (3) a identifié les sites d’initiation primaires dans 14 protéines, y compris la RNase pancréatique bovine A et la myoglobine du cachalot, ainsi que d’autres sites d’initiation moins stables (11) dans la RNase A. le site d’initiation primaire de la RNase A a été identifié dans ce modèle comme étant des résidus 106-118. L’Application de la seconde approche (8) à la RNase A (13) a conduit à six sites (illustré à la Fig., 3 a), qui correspondaient à celles identifiées (11) par la première approche (3). Il s’agit des résidus 4-11 (région A), des résidus 25-34 (région B), des résidus 51-57 (région C) et des structures antiparallèles (pas nécessairement des feuilles plissées) formées par l’association des résidus 53-67 avec les résidus 69-79 (région D), des résidus 71-90 avec les résidus 91-111 (région E) et des résidus 103-111 avec les résidus 115-124 (région F). Les étapes suivantes le long de la voie de pliage consistent en la croissance ou la coalescence de ces régions. La région G est formée lorsque les résidus 36-48 se plient contre l’hélice B., La région G, cependant, contient des contacts à plus longue portée que l’hélice B. Par conséquent, G est considérée comme se formant à un stade ultérieur que B. La région L est formée par association de la région A avec B, G et C. Cette séquence structurelle est suivie par la région H, formée lorsque les régions C et D entrent en contact; par la région K contenant des contacts entre les régions E et F; par la région J dans laquelle les régions C et D forment des contacts avec les régions E et F; et par la région I contenant des contacts des régions E et H avec G. enfin, la région M est formée lorsque la région A entre en contact avec E et F.,
le site d’initiation du repliement primaire prévu de la RNase A est en accord avec le retournement observé aux résidus 113 et 114 dans la molécule native, avec le très haut degré de conservation des résidus apolaires dans le site 106-118 de 23 espèces de mammifères de cette protéine (3), et avec les informations expérimentales sur les intermédiaires détectés dans le repliement thermique de la RNase A (14)., Des preuves RMN de structure locale dans la RNase a dépliée dans des conditions de pliage (15) et dans des fragments de celle-ci (16), et des études immunochimiques sur la formation de sites antigéniques stables (à la surface de la protéine, couvrant le site d’initiation hydrophobe primaire enterré lorsque la RNase a réduite est oxydée (réf. 17 et figure 8 de réf. 18), étaient également compatibles avec cette image. D’autres preuves expérimentales à l’appui de l’existence de sites d’initiation A-F sont fournies dans ref. 11.,
pour l’apomyoglobine, la première approche (3) a identifié le site primaire d’initiation au repliement comme étant les résidus 103-115, qui englobe la majeure partie de l’hélice G, avec la séquence Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-Ser-Glu-Ala-Ile-Ile-His-Val-Leu., L’Application de la seconde approche (8) et les calculs d’énergie conformationnelle ont conduit à suggérer que les interactions entre les hélices A, G et H de l’apomyoglobine pourraient être importantes pour l’initiation du repliement (19), ce qui concorde avec les résultats expérimentaux qui impliquent ces régions dans les intermédiaires d’équilibre de l’apomyoglobine (20) et dans les premières étapes cinétiques de la voie de repliement (21). Des études expérimentales récentes de mutants de la myoglobine (22, 23) fournissent un support convaincant pour les modèles qui incorporent l’initiation hydrophobe et la propagation du repliement.,
L’Apomyoglobine est devenue un paradigme pour la recherche sur les voies de repliement (24). Une partie de la molécule d’apomyoglobine, constituée des hélices A, G et H et d’une partie de l’hélice B, se plie rapidement pour former un intermédiaire sur voie, le reste de la chaîne polypeptidique se repliant à un rythme plus lent, de l’ordre de secondes (21, 25). Les fragments peptidiques d’apomyoglobine correspondant aux hélices G et H ont montré une propension à la structure hélicoïdale (26-28), tandis que les peptides correspondant au reste de la protéine ont montré une propension beaucoup plus faible à la formation d’hélice (29)., Pourtant, une expérience dans laquelle L’hélice H de la myoglobine a été mutée pour diminuer sa propension hélicoïdale (30) a montré très peu d’influence sur le taux de pliage de la protéine. Un effet beaucoup plus important a été observé lorsque l’histidine distale (H64) a été changée en phénylalanine: la substitution d’une chaîne latérale non polaire pour l’histidine polaire enterrée a entraîné une augmentation significative du taux de repliement (31). Ces études ont mis en évidence l’importance de l’emballage de la chaîne latérale, en particulier dans les surfaces de contact des hélices, pour le taux de pliage de l’apomyoglobine.,
L’Apomyoglobine a l’avantage de pouvoir être étudiée à l’équilibre dans un certain nombre de conditions de solution qui se rapprochent de certaines étapes observables sur la voie de pliage cinétique. Ainsi, il a été possible de définir les propensions conformationnelles de l’apomyoglobine dépliée et partiellement pliée par RMN (32-35). Fait intéressant, l’apomyoglobine dépliée à l’acide montre une propension à la structure hélicoïdale non native dans une région qui relie les hélices D et E, ainsi que la structure native observée dans les hélices A et H, qui avait été prédite dans les études cinétiques (34)., Les études RMN des propensions conformationnelles des différentes formes d’apomyoglobine (32-35) ont inclus la détermination des paramètres de relaxation de la chaîne polypeptidique pour déterminer spécifiquement la dynamique de l’épine dorsale dans chacun des états de la protéine. Au lieu de l’analyse” sans modèle » qui convient aux protéines repliées, les données de relaxation ont été analysées en calculant les fonctions de densité spectrale réduite J(0), J(wN) et J(wH) (36). La fonction J (0) informe sur les mouvements d’échelle de temps µs–ms et suggère que, pour l’apomyoglobine à pH 2.,3, les hélices A et G faisaient des contacts transitoires (34). Ce résultat passionnant, validé plus tard par des études RMN de spin-label (37), a fourni des preuves définitives de contacts à longue distance de type natif dans une protéine dépliée. Plus intriguant encore, la fonction J (wN), qui informe sur le mouvement à l’échelle de temps ps–ns, a montré une variation dépendante de la séquence, qui pourrait être corrélée à la variation d’un paramètre calculé, la « surface moyenne enterrée lors du pliage” (AABUF) (10)., Ce paramètre, qui incorpore à la fois la taille des résidus et l’hydrophobicité, est défini pour des acides aminés individuels, mais est habituellement moyenné sur une fenêtre de cinq à neuf résidus dans la séquence et fournit une estimation quantitative alternative de L’hydrophobicité définie par Matheson et Scheraga (3) en termes d’énergie libre de formation. Dans le cas de l’apomyoglobine à pH 2,3, les pics dans le diagramme de J (wN) vs., le nombre de résidus, qui indique une restriction du mouvement à l’échelle de temps sous-ns, correspondait extrêmement bien avec les pics dans le graphique AABUF, qui indiquent un nombre plus élevé que la moyenne d’acides aminés de grande taille et/ou non polaires. Cette observation suggère qu’il existe un motif dans la séquence d’acides aminés, défini par des groupements de grandes chaînes latérales et/ou non polaires, comme dans le modèle de ref. 3, cela conduit à une restriction du mouvement de l’épine dorsale polypeptidique causée par la formation de grappes hydrophobes locales.
Apomyoglobine à pH 2.,3 conserve une faible propension à la structure hélicoïdale dans les hélices A et H, comme en témoignent les déplacements chimiques RMN observés (34). Ces propensions sont abolies en présence d’urée 8 M (35), mais la dépendance séquentielle des taux de relaxation de l’apomyoglobine dénaturée par l’urée montre également une corrélation intrigante avec le paramètre AABUF. Dans ce cas, la corrélation est entre les minima dans J(wH) et les maxima de AABUF, suggérant que les interactions hydrophobes locales qui limitent le mouvement de la colonne vertébrale sur des échelles de temps sub-ns sont persistantes même dans l’urée 8 M.,
pour tester l’hypothèse selon laquelle le paramètre aabuf, c’est-à-dire l’hydrophobicité, pourrait être utilisé pour prédire les sites d’initiation au repliement dans la chaîne polypeptidique, un ensemble spécifique de mutations de l’apomyoglobine a été réalisé (23). L’hélice A, qui participe à l’intermédiaire cinétique qui se forme d’abord lors du pliage de L’apomyoglobine WT, présente une séquence qui donne lieu à un maximum dans le paramètre AABUF, alors que l’hélice E, qui est en fait hautement hydrophobe selon les échelles d’hydrophobicité classiques, présente un AABUF plutôt faible sur toute sa longueur., Dans l’apomyoglobine pliée, la chaîne latérale de Trp-14, dans L’hélice A, se trouve en face de l’épine dorsale de L’hélice E à Gly-73. Une myoglobine à double mutant a été préparée, dans laquelle Trp-14 a été remplacé par Gly, et Gly-73 a été remplacé par Trp. Il a été estimé que la structure repliée de la protéine devrait être peu perturbée par cet échange, mais que le paramètre AABUF pour les hélices A et E devrait être considérablement affecté. La question était de savoir si la voie de pliage serait également affectée. En effet, le repliement du mutant dans lequel G73 et W14 sont échangés se produit par une voie différente de celle de la protéine WT., Toutes les variantes d’apomyoglobine qui ont jusqu’à présent été étudiées se plient via un intermédiaire en phase d’éclatement qui contient une structure hélicoïdale. Dans le cas de L’apomyoglobine en poids, cet intermédiaire contient les hélices A, G et H (ainsi qu’une partie de l’hélice B). Dans le mutant swap G73–W14, l’intermédiaire contient les hélices E, G et H; l’hélice A n’est pas protégée dans la phase initiale de pliage, mais se plie plus tard. Ce résultat illustré à la Fig. 4) a été confirmé par des études de spin-label montrant des contacts entre les hélices E, G et H chez le mutant, plutôt que les contacts A, G et H observés dans la protéine WT.,