Ce matériel est accompagné d’une présentation sur la structure des protéines et les principes de la dénaturation des échantillons et de l’électrophorèse sur gel discontinu.
La séparation de macromolécules dans un champ électrique est appelée électrophorèse. Une méthode très courante de séparation des protéines par électrophorèse utilise un gel de polyacrylamide discontinu comme support et du dodécylsulfate de sodium (SDS) pour dénaturer les protéines. La méthode est appelée électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE)., Le système le plus couramment utilisé est également appelé la méthode Laemmli après U. K. Laemmli, qui a été le premier à publier un article utilisant SDS-PAGE dans une étude scientifique.
le SDS (également appelé lauryl sulfate) est un détergent anionique, ce qui signifie que lorsqu’il est dissous, ses molécules ont une charge négative nette dans une large plage de pH. Une chaîne polypeptidique lie des quantités de SDS proportionnellement à sa masse molecuar relative. Les charges négatives sur SDS détruisent la majeure partie de la structure complexe des protéines et sont fortement attirées vers une anode (électrode chargée positivement) dans un champ électrique.,
Les gels de Polyacrylamide empêchent les grosses molécules de migrer aussi vite que les petites molécules. Étant donné que le rapport charge-masse est presque le même parmi les polypeptides dénaturés SDS, la séparation finale des protéines dépend presque entièrement des différences de masse moléculaire relative des polypeptides. Dans un gel de densité uniforme, la distance de migration relative d’une protéine (Rf, le F en indice) est négativement proportionnelle au log de sa masse., Si des protéines de masse connue sont exécutées simultanément avec les inconnues, la relation entre Rf et masse peut être tracée, et les masses de protéines inconnues estimées.
la séparation des protéines par SDS-PAGE peut être utilisée pour estimer la masse moléculaire relative, pour déterminer l’abondance relative des protéines principales dans un échantillon et pour déterminer la distribution des protéines entre fractions. La pureté des échantillons de protéines peut être évaluée et l’avancement d’une procédure de fractionnement ou de purification peut être suivi., Différentes méthodes de coloration peuvent être utilisées pour détecter des protéines rares et apprendre quelque chose sur leurs propriétés biochimiques. Des techniques spécialisées telles que le western blotting, l’électrophorèse bidimensionnelle et la cartographie peptidique peuvent être utilisées pour détecter des produits génétiques extrêmement rares, pour trouver des similitudes entre eux et pour détecter et séparer les isoenzymes des protéines.
masse moléculaire versus poids moléculaire
la masse moléculaire (symbole m) est exprimée en Daltons (Da). Un Dalton est défini comme 1/12 de la masse de carbone 12., La plupart des macromolécules sont assez grandes pour utiliser le kiloDalton (kDa) pour décrire la masse moléculaire. Le poids moléculaire n’est pas le même que la masse moléculaire. Il est également connu sous le nom de masse moléculaire relative (symbole Mr, où r est un indice). Le poids moléculaire est défini comme le rapport de la masse d’une macromolécule à 1/12 de la masse d’un atome de carbone 12. C’est une quantité sans dimension.
lorsque la littérature donne une masse en Da ou en kDa, elle fait référence à la masse moléculaire. Il est incorrect d’exprimer le poids moléculaire (Masse moléculaire relative) en Daltons., Néanmoins, vous trouverez le terme poids moléculaire utilisé avec les Daltons ou kiloDaltons dans certaines publications, utilisant souvent L’abréviation MW pour poids moléculaire.
gels de Polyacrylamide pour SDS-PAGE
de nombreux systèmes d’électrophorèse des protéines ont été développés, et les appareils utilisés pour SDS-PAGE varient considérablement. La méthodologie utilisée sur ces pages utilise la méthode Laemmli. La référence à la méthode Laemmli dans une section matériaux et méthodes élimine la nécessité de décrire les tampons, la coulée de gels, l’appareil, etc., À moins que le document n’utilise une modification de la méthode, les seuls détails de la FDS-PAGE qui devraient être rapportés dans une section sur les méthodes sont le pourcentage total d’acrylamide (%T) dans un gel, le pourcentage relatif et le type de réticulant (%C), et peut-être une référence aux dimensions du gel. Nous utilisons un système « mini-gel », avec des cassettes de gel 3 1/4″ x 4″.
SDS-PAGE peut être réalisé sur des gels pré-coulés, ce qui évite les problèmes et les risques liés au travail avec de l’acrylamide. La description suivante s’applique aux appareils de coulée et de course fabriqués en atelier qui sont beaucoup moins chers que les équipements disponibles dans le commerce., En plus de la rentabilité, un avantage de fabriquer ses propres gels la première fois est une compréhension plus approfondie du processus.
quel que soit le système, la préparation nécessite de couler deux couches différentes d’acrylamide entre les plaques de verre. La couche inférieure (séparation, ou résolution, gel) est responsable de la séparation des polypeptides par taille. La couche supérieure (GEL d’empilement) comprend les puits d’échantillon. Il est conçu pour balayer les protéines dans un échantillon entre deux limites mobiles afin qu’elles soient comprimées (empilées) en couches minces micrométriques lorsqu’elles atteignent le gel de séparation.,