Kokeellinen Todentaminen Mallit
ensimmäinen lähestymistapa (3) tunnistaa ensisijainen aloittamista sivustot 14 proteiineja, kuten naudan haiman Rnaasi A ja kaskelotti myoglobiinia, ja myös muita vähemmän vakaa aloittamista sivustoja (11) Rnaasi A. ensisijainen aloittamista sivuston Rnaasi A oli tunnistettu tässä mallissa jääminä 106-118. Sovelluksen toinen lähestymistapa (8) Rnaasi A (13) led-kuusi sivustoja (esitetty Kuviossa., 3 A), jotka olivat yhdenmukaisia ensimmäisessä lähestymistavassa yksilöityjen (11) kanssa (3). Nämä ovat jäämiä 4-11 (alue A), jäännökset 25-34 (alue B) en, jäämien 51-57 (alue C), ja antiparallel rakenteet (ei välttämättä laskostettu arkkia) muodostama yhdistys jäämiä 53-67 kanssa jäämiä 69-79 (alue D) en, jäämien 71-90 kanssa jäämiä 91-111 (alue E), ja jäännökset 103-111 kanssa jäämiä, 115-124 (alue F). Taitettavan reitin myöhemmät vaiheet koostuvat näiden alueiden kasvusta tai kivihiilestä. Alue G muodostuu, kun jäännökset ovat 36-48-kertaisia helix B: tä vastaan., Alueella G, kuitenkin, sisältää pitkän kantaman yhteyksiä kuin ei helix B. Siksi, G pidetään muodostaa myöhemmässä vaiheessa kuin B. Alue L on muodostettu association of alueen A, B, G ja C. Tämä rakenteellinen järjestys seuraa alueen S, joka muodostuu, kun alueiden C ja D kosketuksiin; alueen K sisältää yhteyksiä alueiden E ja F; alueittain J jossa alueet C ja D muodostavat yhteyksiä alueiden E ja F; ja alueittain I, joka sisältää yhteystiedot alueiden E ja H G. Lopuksi, alueen M muodostuu, kun alueen tulee kosketuksiin E ja F.,
ennustettu ensisijainen taitto aloittamista sivuston Rnaasi A on kanssa havaittu vuorollaan jäämiä 113 ja 114 natiivi molekyyli, jossa on erittäin korkea säilyttämistä polaarisia jäämiä sivuston 106-118 23 nisäkkäiden lajia tämä proteiini (3), ja kokeellinen välituotteita koskevat tiedot havaitaan lämpö piirtyy Rnaasi A (14)., NMR näyttöä paikallinen rakenne avattuna Rnaasi A alle folding ehdot (15) ja niiden katkelmia (16), ja immunokemiallisia tutkimuksia, muodostumista vakaa antigeeninen sivustoja (pinnalla proteiini, joka kattaa haudattu ensisijainen hydrofobinen aloittamista sivuston kun vähennetään Rnaasi A on hapettunut (ref. 17 ja ref: n kuva 8. 18), olivat myös tämän kuvan mukaisia. Muut kokeelliset todisteet, jotka tukevat aloituspaikkojen A-F olemassaoloa, esitetään viiteasiakirjassa. 11.,
Varten apomyoglobin, ensimmäinen lähestymistapa (3) tunnistaa ensisijainen taitto aloittamista sivuston jäämiä, 103-115, joka kattaa suurimman osan G helix, järjestyksessä Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-Ser-Glu-Ala-Ile-Ile-Hänen-Val-Leu., Sovelluksen toinen lähestymistapa (8), ja conformational-energian laskelmat, johti ehdotusta, että vuorovaikutus joukossa A, G, ja H heliksejä ja apomyoglobin voi olla tärkeää, että taitto aloittamista (19), sopusoinnussa kokeellisten tulosten että sekaantunut näiden alueiden tasapainon välituotteiden apomyoglobin (20) ja varhaisin liike-vaiheet taitto polku (21). Viimeaikaiset kokeelliset tutkimukset myoglobiinin mutanteista (22, 23) antavat vakuuttavaa tukea malleille, jotka sisältävät hydrofobisen initiaation ja taittumisen lisääntymisen.,
Apomyoglobiinista on tullut paradigma taittoväylien tutkimiseen (24). Osa apomyoglobin molekyyli, joka koostuu A -, G -, ja H-heliksejä ja osa B helix, taittuu nopeasti muodostaa oma polku väli, jäljellä polypeptidi ketju taitto hitaammin, jotta sekuntia (21, 25). Peptidi fragmentteja apomyoglobin vastaavat G-ja H-heliksejä osoitti taipumusta kierteiset rakenne (26-28), ottaa huomioon, että peptidit vastaavat jäljellä proteiini osoitti paljon pienempi taipumus helix muodostumista (29)., Vielä kokeilu, jossa S helix myoglobiinin oli mutatoitunut vähentää sen kierteiset taipumus (30) oli hyvin vähän vaikutusta taitto määrä proteiinia. Paljon suurempi vaikutus havaittiin, kun distaalinen histidiini (H64) muutettiin fenyylialaniinin: n korvaaminen ei-polaarisia puolella ketjun haudattu polar histidiini johti merkittävä kasvu korko taitto (31). Nämä tutkimukset huomautti kohti merkitystä, side-ketju pakkaus, erityisesti kontakti pinnat heliksejä, nopea taitto apomyoglobin.,
Apomyoglobin on se etu, että se voidaan tutkia tasapainotilassa alla useita ratkaisu ehtoja arvioitu, että joitakin havaittavia vaiheita, kineettinen taitto polku. Näin, se on ollut mahdollista määritellä conformational taipumuksia avattuna ja osittain taitettu apomyoglobin by NMR (32-35). Mielenkiintoista, happo-avattuna apomyoglobin osoittaa taipumusta ei-natiivi kierteiset rakenne alueella, joka yhdistää D-ja E-heliksejä, sekä natiivi kaltainen rakenne havaittiin A-ja H-heliksejä, joka oli ennustettu liike-opinnot (34)., NMR tutkimukset conformational taipumuksia eri muotoja apomyoglobin (32-35) sisältyvät määrittäminen rentoutumista parametrit polypeptidi ketju-alueelle erikseen määritellä selkäranka dynamics kaikissa maissa, proteiinia. Sen sijaan ”malli-free” analyysi, joka sopii taitettu proteiineja, rentoutumista tiedot analysoitiin laskemalla vähentää spektrin tiheys toiminnot J(0), J(wN) ja J(wH) (36). Funktion J(0) kertoo µs–ms aika-asteikko liikkeet ja ehdotti, että apomyoglobin pH 2.,3, A ja G helices tekivät ohimeneviä kontakteja (34). Tämä jännittävä tulos, myöhemmin vahvistanut spin-label NMR-tutkimukset (37), jos todisteet kotoisin-kuten pitkän kantaman yhteystiedot taittamista proteiini. Jopa enemmän kiehtovan, funktio J(wN), joka ilmoittaa, ps–vl aika-asteikko esitystä, kävi ilmi, sekvenssi-riippuvainen vaihtelu joka voisi olla korreloi vaihtelu on laskettu parametri, ”keskimääräinen pinta-ala on haudattu, kun taitto” (AABUF) (10)., Tämä parametri, joka sisältää sekä jäännös koko ja hydrofobisuus, on määritelty yksittäisiä aminohappoja, mutta on yleensä keskimäärin yli ikkunan viidestä yhdeksän jäämien järjestyksessä ja tarjoaa vaihtoehtoisen määrällinen arvio hydrofobisuus määritelty Matheson ja Scheraga (3) kannalta vapaan energian muodostumista. Apomyoglobiinin ollessa pH 2.3: ssa J: n(wN) juonen huiput vs., jäännös numero, joka osoittaa rajoituksen osa-ns aika-asteikko liike, vastasi erittäin hyvin huiput AABUF juoni, joka osoittaa keskimääräistä suurempi määrä suuria ja/tai ei-polaarisia aminohappoja. Tämä havainto ehdotti, että siellä on kuvio aminohapposekvenssin, määritellään ryhmiä suuri ja/tai ei-polaarisia puolella ketjut, kuten malli ref. 3, joka johtaa paikallisen hydrofobisen klusterin muodostumisen aiheuttaman polypeptidirungon liikkeen rajoittamiseen.
Apomyoglobiini PH 2: ssa.,3 säilyttää pieni taipumus kierteiset rakenne A-ja H-heliksejä arvioituna havaittu NMR kemialliset siirtymät (34). Näitä taipumuksia on poistettu läsnä 8 M urea (35), mutta järjestys riippuvuus rentoutumista hinnat urea-denaturoitu apomyoglobin osoittaa myös, kiehtova korrelaatio AABUF parametri. Tässä tapauksessa korrelaatio on välillä minimit J(wH) ja maxima AABUF, mikä viittaa siihen, että paikallinen hydrofobisia vuorovaikutuksia, jotka rajoittavat selkärangan liike sub-ns aikajänteellä ovat pysyviä jopa 8 M urea.,
testaa hypoteesia, että AABUF parametri, eli hydrofobisuus, voidaan käyttää ennustamaan taitto aloittamista sivustoja polypeptidi ketju, tietty joukko apomyoglobin mutaatiot tehtiin (23). A-helix, joka osallistuu liike-väli, joka on ensin muodostettu, kun taitto WT apomyoglobin, on sekvenssi, joka aiheuttaa enintään AABUF parametri, kun taas E helix, joka on itse asiassa erittäin hydrofobinen mukaan perinteisen hydrofobisuus asteikot, on melko alhainen AABUF koko sen pituudelta., Vuonna taitettu apomyoglobin, puoli ketjun Trp-14, helix, sijaitsee vastapäätä selkäranka E helix klo Gly-73. Valmistettiin kaksoismutanttimyoglobiinia, jossa Trp-14 korvattiin Gly: llä ja Gly-73 korvattiin Trp: llä. Se oli perusteltu, että taitettu rakenne proteiinin pitäisi olla vähän levoton vaihtaa, mutta että AABUF parametrin A-ja E-heliksejä olisi rajusti vaikuttaa. Kysymys oli siitä, vaikuttaisiko myös taittoväylä. Mutantin taittuminen, jossa G73 ja W14 vaihtuvat, tapahtuu eri tavalla kuin WT-proteiini., Kaikki apomyoglobiinimuunnokset, joita on tähän mennessä tutkittu, taittuvat kierteisrakenteen sisältävän murtumisvaiheen välivaiheen kautta. Jos WT apomyoglobin, tämä väli sisältää A -, G -, ja H-heliksejä (ja myös osa B helix). Vuonna G73–W14 swap-mutantti, väli-sisältää E -, G -, ja H-heliksejä; A-helix ei ole suojattu alkuvaiheessa taitto, mutta taittuu myöhemmin. Tämä tulos (kuvitettu Kuvassa. 4) vahvistettiin spin-label tutkimukset osoittavat yhteyksiä E -, G -, ja H-heliksejä mutantti, pikemminkin kuin A, G, ja H yhteystiedot havaittu WT proteiinia.,