Mikä on Polyakryyliamidigeelielektroforeesi (sivu)?

Elektroforeettiset tekniikoita erottaa varautuneet molekyylit sähkökentässä. Liikkuvuutta molekyyli on kääntäen verrannollinen sen kokoon ja suoraan verrannollinen sen maksutta. Elektroforeesin aikana proteiinit liikkuvat kohti vastakkaisesti varattua elektrodia sähkökentässä.,

nopeus niiden liikkeen elektroforeettinen järjestelmä säätelevät useat tekijät, kuten lämpötila, pH, ja puskurin pitoisuus lisäksi sisäisiä ominaisuuksia, kuten koko, varaus ja muoto proteiineja.

Elektroforeettinen erottaminen proteiineja tiukasti perusteella niiden molekyylipaino on mahdollista vain, jos vastuussa kaikista proteiini-molekyylejä voidaan manipuloida sama merkki. Tällöin proteiinimolekyylien liikkuvuus riippuu yksinomaan niiden koosta.,

Polyakryyliamidigeelielektroforeesi (sivu) on tähän ajatukseen perustuva tekniikka, jota käytetään proteiinien erottamiseen niiden koon perusteella.

page

periaatteet sivulla käytetään anionista pesuainetta nimeltä natriumdodekyylisulfaatti (SDS) sitoutumaan proteiineihin ja antamaan niille negatiivisen varauksen. Proteiinit erotetaan elektroforeettisesti niiden koon mukaan käyttämällä sähkökentässä polyakryyliamidista tehtyä geelimatriisia.

Polyakryyliamidia on tuotettu seurauksena polymerointi reaktio välillä akryyliamidi N,N’-metyleeni-bis-akryyliamidin (BIS) käyttämällä katalyyttiä., Polymeroitumisastetta tai ristisilloitusta voidaan säädellä säätämällä akryyliamidin ja BIS: n pitoisuutta.

Mitä enemmän ristisidonta sitä kovempaa geeliä. Kovuus geelin, puolestaan säätelee kitka kokenut makromolekyyleistä, kun he matkustavat kautta geeli aikana SIVU, mikä vaikuttaa resoluution erottaminen.

Loose-geelit (4-8% akryyliamidia) sallivat suuremman molekyylipainon omaavia molekyylejä siirtyä nopeammin läpi geeli, kun kovat geelit (12-20% akryyliamidia) rajoittaa maahanmuuttoa suurten molekyylien ja valikoivasti sallia pienet liikkua geeli.,

SDS-PAGE protocol

1. Näytteiden valmistus:

Proteiininäytteet denaturoidaan kuumentamalla ne pesuaineen SDS: llä ja merkaptoetanolilla. Entinen sitoutuu voimakkaasti proteiineihin, ja antaa heille korkea negatiivinen varaus, kun taas jälkimmäinen vapauttaa sulfhydryyliryhmien, näin saadaan polypeptidi ketjut kuljettaa ylimääräinen negatiivinen varaus ja vastaavat maksutta massa-suhde. Tämä auttaa proteiinien erottelukykyä tiukasti niiden koon perusteella geelielektroforeesin aikana.

2., Geeli valmistelu:

elektroforeettisen geeli on yleensä useita osia, kuten akryyliamidi, BIS, ja puskuri. Seos kaasutetaan estämään kuplamuodostusta geelin polymeroinnin aikana. Polymeroinnin aloittamiseksi lisätään ammoniumpersulfaattia, vapaata radikaalilähdettä ja stabilointiainetta. BIS: ää lisätään myös muodostaen akryyliamidimolekyylien välisiä ristiyhteyksiä, kunnes lopulta muodostuu geeli.

3. Elektroforeesi:

sähkövirtana käytetään proteiineja, jotka siirtyvät geelin kautta positiiviseen elektrodiin, koska niillä on negatiivinen varaus., Jokainen molekyyli liikkuu molekyylipainonsa perusteella eri nopeudella – pienet molekyylit liikkuvat geelin läpi nopeammin kuin suuremmat. Muuttoliike on yleensä nopeampaa suuremmilla jännitteillä. Muutaman tunnin kuluttua proteiinimolekyylit erotetaan toisistaan koon mukaan.

4. Värjäys ja visualisointi:

Kun elektroforeesi on valmis, geeli voidaan värjätä käyttämällä värillisiä väriaineita, kuten Coomassie Brilliant Blue tai etidiumbromidia, jotta erottaa proteiinit näkyvät eri värillinen bändejä geeli.

sitoutumaton väriaine pestään geelistä., Tämän jälkeen värjätyt geelit kuivataan, jotta proteiininauhojen värin voimakkuus voidaan mitata. Radioaktiivisten proteiinien kaistat voidaan havaita autoradiografialla. Proteiinit voidaan myös kvantifioida, koska proteiinipitoisuus on suoraan verrannollinen sitoutuneen väriaineen määrään.

Jotkut geeli-järjestelmien käyttöön seuranta väriaine kuten bromophenol blue yhdessä proteiini näyte – näkyvä etäisyys matkustanut väriaine geeli auttaa päätettäessä vaaditaan kesto elektroforeesi., Bromofenolisininen kulkee näytemolekyylien mukana, kunnes se lopulta päätyy geelin pohjalle. Elektroforeesin on pysähdyttävä tässä vaiheessa, jotta proteiinimolekyylien elektroforeetit eivät pääse geelistä puskuriin.

kirjallisuutta

• Kaikki Elektroforeesi-Sisältöä
• Elektroforeesi Välineenä tutkijat
• Tyypit Capillary Electrophoresis

Lainauksia