Tämä materiaali on liitettävä esitys proteiinien rakenne ja periaatteet denaturointi näytteitä ja epäjatkuva geeli elektroforeesi.
makromolekyylien erottamista sähkökentässä kutsutaan elektroforeesiksi. Hyvin yleinen menetelmä proteiinien erottamiseksi elektroforeesilla käyttää katkonaista polyakryyliamidigeeliä tukivälineenä ja natriumdodekyylisulfaattia (SDS) proteiinien denaturoimiseksi. Menetelmää kutsutaan natriumdodekyylisulfaatiksi polyakryyliamidigeelielektroforeesiksi (SDS-sivu)., Yleisimmin käytetty järjestelmä on myös nimeltään Laemmli menetelmä jälkeen U. K. Laemmli, joka oli ensimmäinen julkaista paperin työllistävät SDS-sivu tieteellisessä tutkimuksessa.
SDS (myös lauryylisulfaatti) on anioninen pesuaine, eli liuetessaan sen molekyyleillä on nettonegatiivinen varaus laajalla pH-alueella. Polypeptidiketju sitoo SDS: ää suhteessa sen suhteelliseen molekulaariseen massaan. Negatiivinen maksuja SDS tuhota kaikkein monimutkainen rakenne proteiineja, ja ovat vahvasti houkutelleet kohti anodi (positiivisesti varautuneet elektrodi) sähkökentässä.,
Polyakryyliamidigeelit estävät suurempia molekyylejä siirtymästä yhtä nopeasti kuin pienemmät molekyylit. Koska maksu-to-massa-suhde on lähes sama joukossa SDS-denaturoitu polypeptidien, lopullinen erottaminen proteiineja on lähes täysin riippuvainen erot suhteellinen molekyylimassa polypeptidejä. Geeli yhtenäinen tiheys suhteellinen migration etäisyys proteiinia (Rf, f alaindekseinä) on negatiivisesti verrannollinen kirjaudu sen massa., Jos tunnetun massan proteiineja ajetaan samanaikaisesti tuntemattomien kanssa, Rf: n ja massan välinen suhde voidaan piirtää ja tuntemattomien proteiinien massat arvioida.
Proteiinia erottaminen SDS-PAGE voidaan arvioida, suhteellinen molekyylimassa, määrittää suhteellinen runsaus suuria proteiineja näyte, ja määrittää jakelu proteiinien joukossa jakeet. Proteiininäytteiden puhtaus voidaan arvioida ja fraktiointi-tai puhdistusmenettelyn etenemistä voidaan seurata., Erilaisia värjäysmenetelmiä voidaan käyttää harvinaisten proteiinien havaitsemiseen ja niiden biokemiallisten ominaisuuksien oppimiseen. Erikoistuneita tekniikoita, kuten Western blotting, kaksiulotteinen elektroforeesi, ja peptidi kartoitus voidaan käyttää havaitsemaan äärimmäisen niukka-geenin tuotteita, löytää yhtäläisyyksiä joukossa, ja tunnistaa ja erottaa isoentsyymien proteiineja.
molekyylimassa vs. molekyylipaino
Molekyyli massa (tunnus m) on ilmaistu Da (Da). Yksi Dalton määritellään 1/12 massa hiili 12., Useimmat makromolekyylit ovat niin suuria, että ne käyttävät kilodaltonia (kDa) kuvaamaan molekyylimassaa. Molekyylipaino ei ole sama kuin molekyylimassa. Se tunnetaan myös nimellä suhteellinen molekyylimassa (symboli Mr, jossa r on alaindeksi). Molekyylipaino määritellään makromolekyylin massan suhteeksi 1/12 hiili-12-atomin massaan. Se on mitaton määrä.
Kun kirjallisuus antaa massa Da tai kDa se viittaa molekyylimassa. On väärin ilmaista molekyylipainoa (suhteellista molekyylimassaa) Daltoneissa., Kuitenkin löydät termi molekyylipaino käytetään Daltonit tai kilodaltonit joissakin kirjallisuudessa, usein käyttämällä lyhennettä MW molekyylipaino.
SDS-PAGE
Polyakryyliamidigeelejä varten on kehitetty monia proteiinielektroforeesijärjestelmiä, ja SDS-PAGE-laitteissa käytettävät laitteet vaihtelevat suuresti. Näillä sivuilla käytetty menetelmä käyttää Laemmli-menetelmää. Viittaus Laemmli-menetelmän materiaalit ja menetelmät-osiossa poistaa tarpeen kuvata puskurit, valu geelit, laitteet, jne., Ellei paperi työllistää joitakin muutoksia-menetelmä, vain yksityiskohdat löytyvät KTT:-SIVU, joka on ilmoitettava menetelmiä jaksossa prosenttia yhteensä akryyliamidi (%T) in geeli, suhteellinen osuus ja tyyppi crosslinker (%C), ja ehkä viittaus geeli mitat. Käytämme ”mini-gel” – järjestelmää, jossa on 3 1/4″ x 4″ geelikasettia.
SDS-PAGE voidaan suorittaa pre-cast geelit, säästää vaivaa ja vaara kanssa akryyliamidia. Seuraava kuvaus koskee kauppa-tehty valu ja käynnissä laitteet, jotka ovat paljon halvempia kuin kaupallisesti saatavilla olevia laitteita., Kustannustehokkuuden lisäksi etu omien geelien tekemisessä ensimmäistä kertaa on prosessin syvempi ymmärtäminen.
järjestelmästä riippumatta valmistelu vaatii kahden eri akryyliamidikerroksen valamista lasilevyjen väliin. Alempi kerros (erottaminen, tai ratkaista, geeli)on vastuussa todella erottaa polypeptidien koon. Ylempi kerros (pinoamisgeeli) sisältää näytteen kaivot. Se on suunniteltu lakaista proteiineja näyte kahden liikkuvat rajat niin, että ne ovat pakattu (pinottu) osaksi mikrometrin ohuita kerroksia, kun ne saavuttavat erottaa geeli.,