Geeli Elektroforeesi Määrittely
Geeli elektroforeesi on menettely, jota käytetään erottamaan biologisten molekyylien koon. Näiden molekyylien erottaminen tapahtuu asettamalla ne geeliin, jossa on pienet huokoset, ja luomalla sähkökenttä geelin poikki. Molekyylit liikkuvat nopeammin tai hitaammin kokonsa ja sähkövarauksensa perusteella.,
Geeli Elektroforeesi Yleistä
prosessi geeli elektroforeesi toimii, koska negatiivisesti varautuneet molekyylit liikkua pois negatiivinen napa sähkövirta ja pienemmät molekyylit liikkuvat nopeammin kuin suuremmat molekyylit. Näin kokoerotus saavutetaan geelin läpi kulkevien molekyylien altaassa. Geeli toimii samalla tavalla kuin siivilä, joka erottaa hiukkaset koon mukaan. Elektroforeesi toimii liikuttamaan hiukkasia käyttäen niiden luontaista sähkövarausta seulan läpi.,
Kun tutkijat yrittävät erottaa eri segmenttien DNA: ta, esimerkiksi, prosessi on yksinkertainen. Näytteet Ladataan kanaviin geelin alussa. Jokaisella DNA-molekyylillä on sama varaus (-1), koska DNA muodostuu samoista 4 nukleotidista ja sillä on aina hieman negatiivinen varaus koosta riippumatta. Siksi jokaisella DNA-molekyylillä on sama voima, joka vetää sen geelin läpi.
kunkin molekyylin koko kuitenkin estää sen etenemisen geelin läpi., Suuret molekyylit osuvat geelimatriisin osiin ja hidastuvat. Pienet DNA-molekyylit voivat liukua eri osien geeli matriisi, ja nopeasti tehdä tiensä toiselle puolelle geeli. Tietyn ajan kuluttua värjätyt DNA-molekyylit voidaan nähdä aggregoitumassa geelin eri alueilla sen perusteella, kuinka pitkälle ne liikkuivat geelielektroforeesin aikana. Näin tutkijat voivat tunnistaa segmentit ja vertailla eri eliöiden DNA: ta.
mihin Geelielektroforeseja käytetään?,
tarkoituksena geeli elektroforeesi on visualisoida, tunnistaa ja erottaa molekyylejä, jotka on käsitelty edellisessä menetelmässä, kuten PCR, entsymaattinen ruoansulatusta tai kokeellinen kunnossa. Usein aiemmasta kokeesta/menetelmästä kerätyt nukleiinihappojen tai proteiinien seokset ajetaan geelielektroforeesin avulla molekyylien identiteetin määrittämiseksi tai erottamiseksi toisistaan.,
Geeli Elektroforeesi Vaiheet
laaja vaiheet, osallistuvat yhteisen DNA-geeli elektroforeesi pöytäkirjaa:
Valmistautuminen näytteet käynnissä
DNA on eristetty ja esiprosessoitu (esim PCR, entsymaattinen digestio) ja liuokseksi joitakin perus sininen väriaine auttaa hahmottamaan liikkeen näytteen läpi geeli.
On agaroosi TAE-geelillä ratkaisu on valmis
TAE-puskuri sisältää lähde-ionien määrittämiseen sähkökentän aikana elektroforeesi., Liuoksen valmistuksessa käytetään agaroosin paino-tilavuuspitoisuutta TAE-puskurissa. Jos esimerkiksi tarvitaan 1% agaroosigeeliä, lisätään 1 g agaroosia 100 ml: aan TAE. Käytetty agaroosiprosentti määräytyy sen mukaan, kuinka suuri tai pieni DNA: n oletetaan olevan. Jos yksi etsii erottamalla altaan pienempi koko DNA-bändit (<500bp), suurempi osuus agaroosia geeli (>1%) on valmis. Suurempi agaroosiprosentti luo tiheämmän seulan, joka lisää pienten DNA: n pituuserojen erottelua., Agarose-TAE-liuos kuumennetaan agaroosin liuottamiseksi.
Valu geeli
agaroosi TAE ratkaisu on kaadetaan valu tarjotin, että kun geeli ratkaisu on jäähtynyt ja jähmettynyt, luo geeli, laatta rivi wells yläreunassa.
elektroforeesikammion asettaminen
kiinteä geeli asetetaan kammioon, joka on täytetty TAE-puskurilla. Geeli on sijoitettu niin, että kammiokaivot ovat lähimpänä kammion negatiivista elektrodia.,
Lastaus-geeli
geeli jaosto kaivot ovat täynnä DNA-näytteitä ja yleensä, DNA ladder on myös ladattu referenssinä kokoja.
Elektroforeesi
negatiiviset ja positiiviset johdot on kytketty kammioon ja virtalähde jossa jännite on asetettu. Virran kytkeminen virtalähde määrittää sähkökentän ja negatiivisesti varautuneet DNA-näytteet alkavat kulkeutua läpi geeli ja pois negatiivinen elektrodi kohti myönteisiä.,
Pysäyttää elektroforeesi ja visualisoida DNA: ta
Kun sininen väriaine DNA-näytteitä on siirtynyt läpi geeli tarpeeksi pitkälle, että virtalähde on kytketty pois päältä ja geeli poistetaan ja sijoitetaan osaksi etidiumbromidi ratkaisu. Etidiumbromidi interkaloi DNA: n välillä ja näkyy UV-valossa. Joskus etidiumbromidia lisätään suoraan agaroosigeeliliuokseen vaiheessa 2. Etidiumbromidin värjäämä geeli altistuu tämän jälkeen UV-valolle ja siitä otetaan kuva. DNA-kaistat visualisoidaan jokaisesta kammiokaivoa vastaavasta kaistasta., Myös ladatut DNA-tikapuut visualisoidaan ja DNA-nauhojen pituutta voidaan arvioida. Esimerkki on alla olevassa kuvassa.
Tyypit Geeli Elektroforeesi
On olemassa kahdenlaisia geeli elektroforeesi: native ja denaturointi. Natiivigeelielektroforeesi pyrkii yleensä pitämään RNA: n tai proteiinin alkuperäisessä rakenteessaan ajaessaan sitä geelin läpi., Denaturointi geeli elektroforeesi yrittää vähentää RNA: ta tai proteiinia osaksi sen kaikkein lineaarinen rakenne ennen tai sen aikana geeli elektroforeesi.
RNA: n tai proteiinin denaturaatio saadaan aikaan lisäämällä näytteeseen pelkistävä aine, geeli ja / tai puskuri. Pelkistäjä erottaa sidokset RNA-tai proteiinimolekyylin sisällä ja vähentää siten sen sekundaarista rakennetta. Proteiinin tai RNA: n sekundaarinen rakenne vaikuttaa epälineaarisesti siihen, kuinka nopeasti se vaeltaa geelin kautta., Denaturoitu, lineaarinen RNA-tai proteiinimuoto kuitenkin siirtyy suhteessa sen lineaariseen kokoon (emäsparit tai kilon Daltonit). Denaturointi geeli elektroforeesi on usein tarkempi koon tunnistus, kun taas natiivi geeli elektroforeesi käytetään yleensä tunnistamaan suurempi proteiini kompleksit.
esimerkkejä Geelielektroforeesista
- tae Agaroosigeelielektroforeesista käytetään yleisimmin DNA: ssa.
- TBE ja Denaturointisivu (polyakryyliamidigeelielektroforeesi) ovat yleisiä RNA-erotuksessa.,
- SDS PAGE on denaturointigeelielektroforeesi, jota käytetään yleisesti proteiinien tunnistamiseen ja erottamiseen.