Löytö SmacCas9
muuttaa esi 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) PAM spesifisyys SpyCas9, varhainen ja viimeaikaiset raportit ovat käyttäneet suunnattu evoluutio (esim., ”VQR”, ”EQR”, ”VRER”, ja ”NRNH” variantteja) tai järkevä suunnittelu ilmoitti, crystal rakenne (esim, ”QQR”, ”NG”, ja ”NR” variantteja)17,18,19,20,21,22. Nämä raportit keskittynyt PAM-yhteyttä arginiini jäämiä R1333 ja R1335, että poistaa toiminnon kun ainoastaan mutatoitunut., Vaikka nämä tutkimukset tunnistaa korvaavia mutaatioita, jolloin muutettu PAM erityispiirteet, Cas9 vaihtoehtoja, että ne on tuotettu säilyttänyt guaniini etusija vähintään yksi asema PAM järjestyksessä raportoitu in vivo-editointi. Samanaikaisesti kertomuksissa on käytetty evoluution tiedot edelleen rentoutua kanoninen 5\(^{\prime}\)-NNGRRT-3\(^{\prime}\) PAM spesifisyys Staphylococcus aureus-Cas9 (SaCas9) tai löytää vaihtoehto 5\(^{\prime}\)-NNNNCC-3\(^{\prime}\) PAM spesifisyys kanoninen 5\(^{\prime}\)-NNNNGHTT-3\(^{\prime}\) PAM Neisseria meningitidis Cas923,24., Molempien uusien raporttien nukleaasit suosivat kuitenkin edelleen GC-sisältöä ainakin yhdessä Pam-sekvenssin asemassa. Meidän tavoitteena on nostaa tällaisia GC-sisältö edeltävät opinnot kautta mukautetun bioinformatiikka-ajettu työnkulku, että kaivosten olemassa olevien PAM monimuotoisuuden Streptococcus genus25. Käyttämällä tätä strategiaa, suunnistimme SmacCas9 olevan potentiaalia karhu muuttaa non-GC PAM spesifisyys kun kohdistamalla 115 orthologs ja SpyCas9 alkaen UniProt (vain ne, joissa on enemmän kuin 70% pairwise BLOSSOM62 pisteet)., Vuodesta linjaus löysimme SmacCas9 oli toinen kahdesta lähellä homologeista, sekä Streptococcus mutans B112SM-A-Cas9 (SmutCas9), jolla glutamines molemmat kannat linjassa muuten erittäin säilytetty PAM-yhteyttä arginines (Fig. 1a-b; täydentävä Kuva. 2 A). Arginiini-ainejäämät ovat tiedossa voimakkaasti mieluummin guanines vuonna amino-happo-emäs vuorovaikutus maisema, mistä on osoituksena 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) spesifisyys SpyCas9. Glutamiini jäämiä, toisaalta, ensisijaisesti sitoutua adenines, vuorovaikutuksessa merkittävä ura edge26., Meillä on siis arveltu, että SmacCas9 oli luonnollisesti coevolved tarvittavia korvaavia mutaatioita saada uusia adeniini-rikas PAM tunnustamista. Pieni otoskoko 13 välilevyt vastaavan genomi on CRISPR array voitu varmuudella päätellä, että SmacCas9 PAM in silico., Kuitenkin mahdollisuus SmacCas9 tarvitaan vähemmän GC-pitoisuus sen PAM tukivat järjestyksessä yhtäläisyyksiä ”QQR” variantti, joka on 5\(^{\prime}\)-NAAG-3\(^{\prime}\) specificity27, lisäksi AT-rikas oletettu konsensus PAM varten faagi-peräisin olevien välilevyjen CRISPR taulukot liittyy erittäin homologinen SmutCas9, joka tunnistettiin tuella meidän aiemmin kuvatun SPAMALOT putki ja yhdenmukainen aiempien ennusteita (Kuva. 1c; täydentävä Kuva. 2 B; täydentävä Kuva. 3) 25,28.
Sekvenssin linjaus SpyCas9, sen QQR variantti, ja SmacCas9. Alleviivattavan punaisen linjan askel merkitsee SpyCas9: n ja SmacCas9: n liittymistä SpyMac-hybridin rakentamiseen. Sekvenssi logo (Weblogo online-työkalu) välittömästi alla linjaus kuvaa säilyttäminen klo 11 tehtävissä ympäri PAM-yhteyttä arginines ja SpyCas9., b-toimialueen organisaatio SpyCas9 rinnastuvat yli värikoodatut rakenne RNA-ohjattu, kohde-sidottu SpyCas9 (PDB ID 5F9R). Molemmat DNA-säikeet ovat mustia lukuun ottamatta Pamia vastaavaa magenta-segmenttiä. Sininen–vihreä–punainen väri kartassa on käytetty merkintöjä Cas9 PI verkkotunnuksen ja ohjata spacer järjestyksessä korostaa rakenteita, jotka antavat järjestyksessä erityisyys ja yleisyys intra-domain yhteystiedot sisällä PI43. c-sarja, logo syntyy verkossa (WebLogo), että oli syöttö oletetun PAM sekvenssit löytyy Streptococcus faagin ja liittyvät lähellä SmacCas9 homologeista.,
Suunnittelu ja PAM luonnehdinta SpyMac
Me eteni empiirisesti määrittää PAM mieltymykset useita Streptococcus orthologs, että vaihtaa yhden tai molemmat kriittinen PAM-yhteystiedot. Perustuu osoitti esimerkkejä PAM-vuorovaikutus verkkotunnus (PID) ja opas-RNA (gRNA), joilla on rajat-yhteensopivuus Cas9 orthologs, jotka ovat läheisesti ja aktiivinen, meidän on rakennettava uusia variantteja, joita rationaalisesti vaihtaa PI-alueella katalyyttisesti ”kuollut” SpyCas9 (dSpyCas9) kanssa valittu orthologs (Supplementary Fig., 2A-B) 29,30. Koottu variantteja, mukaan lukien dSpyMacCas9 (jäljempänä dSpyMac), olivat erikseen cotransformed osaksi E. coli-soluissa, sekä opas-RNA johdettu S. pyogenes ja 8-mer PAM library yhtenäinen pohja edustus PAM-SCANR geneettinen piiri, perustettu Leenay et al.31. Piiri säätää vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) toimittajan suhteessa PAM-sitoutumisvahvuuteen. Siksi keräsimme GFP-positiiviset solupopulaatiot virtaussytometrialla(täydentävä Kuva., 4) ja Sanger sekvensoi ne ympäri Pam sivuston määrittää kanta-viisas pohja mieltymykset vastaavan variantin PAM tunnustusta. dSpyMac, enemmän niin kuin dSpyMutCas9, syntyy jälki-profiili, joka on eniten sopusoinnussa guaniini-riippumaton PAM tunnustaminen, sekä hallitseva spesifisyys adeniini dinucleotides (Fig. 2 a; täydentävä Kuva. 2 C).
Kromatogrammien edustava PAM-SCANR perustuva rikastaminen variantti-tunnustaa PAM sekvenssit 5\(^{\prime}\)-NNNNNNNN-3\(^{\prime}\) kirjasto. b SYBR-petsattu agaroosia geelit osoittaa in vitro ruoansulatusta 10 nM 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) substraattien, kun 16 minuutin inkubaation 100 nM puhdistettua ribonucleoprotein entsyymi kokoonpanot. Nuolet erottavat halkaistujen tuotteiden hionnan päällystämättömästä alustasta (ylänauha)., Matrix tontteja tiivistää cleaved murto laskelmat, jotka toteutettiin mukautetun script käsittely geeli kuvia. Näytteet tehtiin itsenäisinä biologisina kaksoiskappaleina (n = 2). C smaccas9: n ja SpyMac: n DNA: n substraatin pilkkoutumisen Aikamittaukset. d-DNA-substraatista pilkkominen funktiona 0.25:1, 1:1 ja 4:1 moolisuhteita ribonucleoprotein kohdistaa villi-tyyppi SpyCas9 ja hybridi SpyMac. Lähdetiedot toimitetaan Lähdetietotiedostona.,
Seuraavaksi puhdistettu nuclease-aktiivisia entsyymejä jatkaa hyvää DNA: n kohteen tunnistus potentiaalin ja ainutlaatuisuuden SpyMac. (Täydentävä Kuva. 5A) 27,32. Emme erikseen hautonut ribonucleoprotein monimutkainen entsyymejä (koostuu Cas9 + crRNA + tracrRNA) kanssa kaksinkertaisen-pulaan kohde substraatteja, kaikki 5\(^{\prime}\)/3\(^{\prime}\)-naapurimaiden pohja yhdistelmiä on nikotiiniamidiadeniinidinukleotidin PAM (5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\); Fig. 2 B)., Lyhyt 16-min ruoansulatusta merkitty sekä villi-tyyppi SmacCas9 ja hybridi SpyMac halkaistut vieressä 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) aiheita laajemmin ja tasaisemmin kuin aiemmin raportoitu QQR variantti. SpyMac kunnostautui edelleen nopeilla DNA-leikkausnopeuksilla, jotka muistuttavat SpyCas9: n fast digest-kinetiikkaa (Kuva. 2c-d)33. Teimme reaktioita, joissa käytettiin vaihtelevia crRNA-spacer-pituuksia ja tracrna-sekvenssiä, koska jälkimmäinen eroaa hieman S. macacae-ja S. pyogenes-genomien (täydentävä Kuva. 5B-E)., Kumpikaan näistä kahdesta parametrit kompensoi hitaampi pilkkominen määrä SmacCas9, mutta emme huomaa, marginaalinen parannus toimintaa, wild-tyyppi-lomakkeen kanssa sen natiivi tracrRNA, joka comports kanssa käyttöliittymä guide-Cas9 vuorovaikutus on enimmäkseen ulkopuolella PI domain.
Genomin editointi iSpyMac
CRISPResso2 indel analyysin jälkeen NGS osa genomista monistettiin alueet arvioitava kohde editointi iSpyMac verrattuna SpyMac ja SpyCas9, on ilmoitettu 5\(^{\prime}\)-NAA-3\(^{\prime}\) ja 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) PAM sekvenssit. Näytteet otettiin kahdessa itsenäisessä transfektioreplikaatissa (n = 2). B tehokkuus heatmap of mismatch tolerance assay on genomitavoitteet., Määrälliset indel taajuuksia, kun arvioidaan VUOROVESI algorithm41, ovat esillä kukin lukee yhden tai kahden hengen epäsuhta sgRNA sekvenssi merkitty Cas9 variantti, ja ilmoitti, PAM järjestyksessä. Näytteet otettiin kahdessa itsenäisessä transfektioreplikaatissa (n = 2). C CRISPResso2 genominen base editing analysis jälkeen NGS genomisten amplicons arvioida muuntaminen sytosiinit kateenkorvaa iSpyMac-BE3. Näytteet otettiin kahdessa itsenäisessä transfektioreplikaatissa (n = 2). Kaikki lähdetiedot toimitetaan Lähdetietotiedostona.,
Seuraavaksi arvioidaan toleranssi iSpyMac, jotta ristiriitaiset sekvenssit, käyttämällä sgRNAs kätkeminen yhden tai kahden hengen erojen kiinteä protospacer sisällä AAVS geeni, jolla on 5\(^{\prime}\)-GAAG-3\(^{\prime}\) PAM järjestyksessä. iSpyMac osoittanut editointimahdollisuus tavoitteista yhden kohtaanto sisällä PAM-proksimaalinen segmentti sgRNA., Lieventää tätä pitäisi off-tavoite taipumus, otimme käyttöön R691A mutaatio, joka oli aiemmin eristetty kautta bakteeri valinta SpyCas9 ylläpitää korkeaa kohde toimintaa ja vähentää off-tavoite editing35. Meidän hifi-variantti, HiFi-iSpyMac, esillä lähes olematonta toimintaa ristiriitaiset sekvenssit, verrattuna alkuperäiseen entsyymi, minimaalisella menetys on-kohde-aktiviteetti (Kuva. 3 B).,
Lopuksi, olemme valittu ikkuna neljä nukleotidien VEGFA locus sarjan yhteydessä niin, että kaikki muut CRISPR endonuclease kanssa todettu, käytä base-editointi ei salli niiden pohja editointi sytidiinin kautta-sulatettu enzyme36. Näin ollen meidän cotransfected HEK293T-solut kanssa nickase muodossa iSpyMac johdettu aiemmin raportoitu BE3 arkkitehtuuri sytosiini pohja editointi (iSpyMac-BE3) ja sgRNA plasmidi kohdistaminen PAM loppupään valitun nucleotides5., Mittasimme tehokas pohja muokkaaminen tasoa korjattu soluja, jossa esillä yli 20% sytosiini, jotta tymiini muuntaminen näiden positioiden kautta NGS-analyysi (Kuva. 3 C).