en la práctica, encontrar una verdadera coincidencia espectral entre cualquier AU y la orina humana es imposible, pero el grado de semejanza es una medida confiable. Se comparan tres lotes de AU en términos de SG, pH y espectro IR como la medición de la coincidencia con la orina humana. También se aplica un análisis estadístico a los espectros IR. Después del agua, el componente principal de la orina es la urea., De hecho, la contribución espectral de la urea a la UA es dominante en comparación con otros componentes (Fig. 1 y suplemento Fig. S2). La creatinina y el citrato de sodio son el segundo y tercer componente con profundas contribuciones espectrales.
Infrarrojos espectros de absorbancia de nueve compuestos utilizados en el MP-AU formulación. Escala de los ejes verticales no son iguales. Las absorbancias relativas se dan en la gráfica 3D en la Fig suplementaria. S2., La relación señal-ruido está limitada en ATR diamond en la región de 2600-2000 cm-1, y por lo tanto está excluida de la pantalla. NaCl, KCl y CaCl2 no tuvieron ninguna absorción en la ventana medida y, por lo tanto, están excluidos de ambas figuras. También la absorción de K2C2O4 es muy débil, y por lo tanto su espectro se excluye de la figura. Las posiciones máximas se presentan en la tabla suplementaria S2.
BK-AU, CT-AU y MP-AU están preparados como se describe en el Método. BK-AU y CT-AU comparten sustancias químicas comunes en sus protocolos., Sin embargo, mientras que ambos incluyen bicarbonato, este compuesto no se encuentra naturalmente en orina humana sana1. Por lo tanto, el bicarbonato no se utilizó en la formulación de MP-AU. Las concentraciones de sustancias químicas son diferentes cuando se comparan BK-AU y CT-AU, ya que los dos estudios se basan en literatura diferente con respecto a la composición de la orina. A pesar de las diferencias en las fórmulas, todas las AUs tienen propiedades físicas aceptables en términos de SG y pH (Tabla 3), y todos los ingredientes están dentro de los rangos fisiológicos según el catálogo de pruebas de Mayo Clinic., Por otro lado, la orina es una solución compleja por naturaleza y comparar cualquier formulación de AU con la orina humana basada en solo dos parámetros (SG y pH) es un enfoque ciego en el mejor de los casos. Por lo tanto, utilizamos un análisis espectroscópico utilizando FTIR para señalar similitudes y/o diferencias entre las AUs, y las comparamos con muestras de orina humana.
orina humana
Los espectros de absorbancia de muestras de orina de 28 individuos sanos se muestran en la Fig. 2. Generalmente, los espectros de la orina humana muestran el mismo perfil, particularmente en la ventana de 1800-1200 cm−1 del espectro. Sin embargo, hay variaciones significativas entre los individuos en el rango de 1200-800 cm−1. Puede ser debido a las diferencias de dieta, género y metabolismo. Cuando se calcula la varianza, los picos más prominentes se ven en 1644, 1574, 1436, 1105 y 1065 cm-1., Según nuestra base de datos de espectros obtenidos de ingredientes individuales (Fig. 1), Las variaciones en el nivel de creatinina, citrato, urea, fosfato y ácido úrico pueden haber contribuido a estas diferencias junto con otros componentes de la orina. Se calcula el promedio de 28 muestras de orina y se utiliza a continuación para la comparación (Fig. 2).
Infrarrojos espectros de absorbancia de 28 individuos sanos de edad de 20 a 40 años., B) el espectro medio calculado de la orina humana se muestra en negro y la variación entre 28 espectros de orina se muestra en rojo.
Urinas artificiales
la orina humana media calculada se compara con los tres espectros AU como se muestra en la Fig. 3. Los perfiles de banda y las posiciones se ven similares en muchos puntos, a saber, 1657, 1609, 1447, 1143 y 783 cm-1 (Fig. 3). Estas bandas se originan principalmente de urea. Sin embargo, también hay variaciones y desviaciones significativas de estas posiciones, como se analiza en detalle en lo que sigue.,
espectro de absorbancia infrarroja de MP-AU (rojo), CT-AU (Verde), BK-AU (azul) junto con el espectro de la orina saludable promedio de 28 participantes (negro) en la región de huellas dactilares. La figura de entrada muestra los mismos espectros en la región de 3800-2500 cm-1.
todos los espectros comparten características comunes en la región de frecuencia más alta (4000-2500 cm-1) (Fig. 3-entrada)., Las dos absorbancias más altas centradas alrededor de 1600 cm-1 y 1445 cm−1 se deben principalmente a la urea con una contribución relativamente menor de la creatinina. Las ligeras diferencias en la absorbancia de AUs se deben principalmente a las diferencias en la concentración de urea en las formulaciones respectivas. Por otro lado, la región entre 1200 cm−1 y 800 cm−1 muestra variaciones significativas. La diferencia más prominente es la absorbancia a 975 cm-1 en BK-AU (Fig. 3). En esta posición, todos los espectros AU tienen diferentes números de picos en diferentes posiciones., Esta región es la colección de una serie de picos procedentes principalmente de la urea, ácido úrico, creatinina y fosfato de sodio (Fig. 1 y suplemento Fig. S2). Por lo tanto, las ligeras variaciones en la concentración de estos compuestos producen un perfil muy diferente en el espectro.
El análisis de componentes principales (PCA) se utiliza para la diferenciación de tres espectros de orina artificial promedio con respecto a la orina humana promedio en toda la región del número de onda (4000-600 cm−1) (Fig. 4A). El primer componente principal (PC1) (72,7%) y el segundo componente principal (PC2) (19.,5%) representan el 92% de la varianza total. La gráfica de puntuación muestra que la MP-AU muestra una mayor similitud con la orina humana promedio en comparación con otras formulaciones de AU cuando se tienen en cuenta todos los espectros. Este análisis también se aplica a las tres mediciones de AUs y a todas las mediciones de orina humana de 28 individuos sanos. Las comparaciones se muestran en dos regiones del espectro IR, es decir, 1400-1200 cm-1 (Fig. 4B) y 1000-800 cm-1 (Fig. 4C). En ambas regiones, MP-AU es más exitoso en imitar las características espectrales de la orina humana., Mientras que BK-AU es más exitoso en comparación con CT-AU en la región de 1400-1200 cm−1, es lo contrario en la región de 1000-800 cm-1. Las bandas o compuestos que explican estas diferencias se discuten en las siguientes secciones.
gráfico de puntuación del análisis de componentes principales aplicado al espectro promedio de orina humana (HU) y mediciones de orina artificial. La gráfica compara espectros en el rango completo de número de onda (4000-600 cm-1) (A)., Gráfico de puntuación de todas las mediciones de IR comparadas en el rango de 1400 cm−1 (B) y en el rango de 1000-800 cm−1 (C).
comparación de orina humana y MP-AU
hay una coincidencia satisfactoria entre el espectro de MP-AU y la orina humana cuando se comparan los perfiles de absorción (traza gris) y de segundo derivado (traza roja) (Fig. 5A, B). Dos espectros no son significativamente diferentes en el nivel de 0.05 basado en la prueba de Mann-Whitney (Z = -1) (tabla suplementaria S3). La región entre los 1800-1400 cm-1 es casi común como lo sugieren los perfiles de la segunda derivada., Sin embargo, el pico en 1390 cm−1 es diferente. La absorción (traza gris) en este punto en MP-AU no es tan alta como en la orina. Esta absorción se debe a la presencia de citrato de sodio (Fig. 1 y cuadro suplementario S2). Aunque la cantidad de citrato es el valor medio del rango fisiológico, el desajuste puede indicar una gran cantidad de citrato en voluntarios. La concentración de citrato en la orina puede variar dependiendo de la dieta., Por ejemplo, en la dieta al estilo DASH (Dietary Approaches to Stop Hypertension) (rica en verduras, frutas, granos integrales, alimentos bajos en lípidos, pescado, carne, nueces y frijoles; limitada en carne roja, frutas endulzadas con azúcar, bebidas y grasas), la cantidad de citrato aumenta en la orina37.
los picos en 1343, 1301, 1278 y 1242 cm-1 son casi iguales en posición (Fig. 5B-traza gris) y en términos de la relación relativa de amplitudes, excepto que el pico a 1301 cm−1 es menos obvio desde el espectro de absorbancia. MP-AU proporciona la mejor coincidencia en esta región de 1350-1200 cm-1 en comparación con otras UA., En la región de 1200-1000 cm-1, en lugar del pico de 1031 y 1045 cm−1 en la orina humana (Fig. 5A-traza roja), hay un pico a 1039 cm−1 en MP-AU (Fig. 5B-traza roja). La coincidencia espectral entre los dos espectros en la región 1000-600 cm−1 es satisfactoria. Una diferencia está en la posición 928 cm-1 en el espectro de absorción de orina. Esta banda se encuentra en 922 cm−1 en MP-AU. Cuando se examinan los perfiles derivados segundos, este pico se ve como la superposición de dos picos. El mayor contribuyente es un pico en 929 cm-1, con una contribución menor de otro pico en 916 cm−1 en el espectro urinario., Sin embargo, en MP-AU la amplitud de absorción de 929 cm−1 es menor, lo que desplaza la posición de la envoltura hacia abajo a 922 cm−1. Esto podría deberse al rico contenido de orina humana que proporciona absorbentes adicionales a 929 cm−1 que no están incluidos en MP-AU.
comparación de orina humana y TC-AU
la región de 1800-1400 cm−1 del espectro de absorbancia es muy similar al espectro de orina en la misma región, que se correlaciona principalmente con el contenido de urea (Fig. 5A, C). El espectro CT-AU también tiene éxito en igualar el hombro a 1390 cm-1., El rango fisiológico normal para el citrato es de 0.2-1.2 g / d31. En la formulación de CT-AU, la cantidad de citrato corresponde a 2 g / d (suponiendo 1,5 L de micción por día), que es más que el punto máximo del rango fisiológico. Parece que el espectro promedio de orina refleja una gran cantidad de citrato como se indica en la sección anterior. Cuando se compara toda la región de huellas dactilares del espectro CT-AU con el espectro urinario humano utilizando la prueba de Mann-Whitney, en el nivel de 0.05, dos espectros son significativamente diferentes (Z = -13.5) (tabla suplementaria S4).,
en el espectro urinario humano, se observa que la banda a 1238 cm−1 se encuentra a 1246 cm−1 en el espectro CT-AU (Fig. 5c-traza roja). Lo que no está claro, sin embargo, es si las dos bandas reflejan la vibración del mismo grupo molecular, o son absorciones no relacionadas. La orina humana tiene múltiples absorbancias en la región de 1200-1000 cm-1. Aunque la mayoría de los componentes son comunes entre la orina y la TC-AU, hay diferencias significativas en términos de las proporciones relativas de las bandas y, por lo tanto, el perfil general es diferente., Las posiciones máximas son generalmente similares, excepto la de 1045 cm−1 en el espectro urinario, que se encuentra a 1050 cm−1 en la TC-AU. Además, el pico de 1031 cm−1 falta en el espectro CT-AU. La diferencia de amplitud más prominente es de 1107 y ~1070 cm-1. Una cantidad insuficiente de compuestos de fosfato, creatinina y ácido úrico podría haber contribuido a la diferencia en estas posiciones. La región es una superposición de muchos grupos vibracionales que se encuentran en diversas formaciones moleculares como lípidos, proteínas, glucosa y sus derivados, y en ácidos nucleicos., Por lo tanto, hacer coincidir un espectro AU con el de la orina humana es casi imposible en esta región de 1200-1000 cm−1. Otra diferencia importante es el pico de 965 cm−1 observado en la TC-AU, pero no en el espectro urinario humano. No tenemos datos suficientes para discutir la posible causa de esta banda ya que ninguno de los componentes de orina que medimos absorben en esta posición. El último punto en la comparación de la TC-AU con la orina humana es la ausencia de Picos de 928 y 866 cm-1 en la TC-AU.,
comparación de orina humana y BK-AU
el perfil espectral general de BK-AU también es similar a la orina humana en muchos puntos (Fig. 3). Las tres absorbancias más altas en las posiciones 1657, 1609 y 1447 cm−1 en el espectro urinario humano coinciden en términos de apariencia general, pero varían ligeramente en la posición máxima en el espectro de BK-AU (Fig. 5A, D-trazas grises). Sin embargo, el pico en 1491 cm−1 (visto como un hombro en el pico de 1446 cm−1 en el espectro de absorbancia) es más pronunciado en BK-AU. Esta posición podría atribuirse a la creatinina (Fig. 1 y cuadro suplementario S2)., La cantidad de creatinina utilizada en la formulación de BK-AU está dentro del rango fisiológico normal, aunque es menor que el valor medio. De hecho, la cantidad de creatinina en la formulación de MP-AU es más, pero la absorbancia a ~1490 cm-1 es menor. Por lo tanto, un pico tan pronunciado no puede explicarse por la cantidad de creatinina. Por otro lado, observamos un aumento de amplitud en esta posición cuando se agrega sulfato de sodio a la solución mientras se prepara MP-AU, aunque el sulfato de sodio no tiene una absorbancia en esta región. El sulfato de magnesio no crea este efecto., Con base en esta experiencia, creemos que el aumento de la absorbancia a ~1490 cm−1 está relacionado con la cantidad de sodio en la formulación de BK-AU. La concentración total de sodio utilizada en la formulación de BK-AU está más allá del rango fisiológico y es la máxima entre las tres AUs. En la siguiente sección se presenta una comparación detallada del contenido químico.
se observa un desajuste de los perfiles espectrales entre la BK-AU y la orina a ~1390 cm-1 (Fig. 3). La amplitud en esta posición es mayor en el espectro urinario. Este pico se atribuyó al citrato en secciones anteriores., Sin embargo, muchos modos vibracionales C-H también absorben en esta región, como el modo de deformación simétrica del grupo metilo a 1380-1390 cm−138,39. En la orina humana, hay una serie de fuentes de CH3 junto con creatinina 1, como 3-Metilhistidina, ácido acético, acetona, ácido alfa-Hidroxiisobutírico, 5-metil-2-hexanona, etc. que contribuyen a la absorción a 1390 cm-1. La falta de tales compuestos podría haber dado lugar a la amplitud más baja en 1390 cm−1.
el pico de 1345 cm−1 en el espectro urinario humano se encuentra en 1341 cm−1 en el espectro BK-AU (Fig. 5A, D-trazas rojas)., Esta banda se origina principalmente de urea (1331 cm-1), ácido úrico (1346 cm−1) y creatinina (1333 cm−1), y recibe una contribución menor del citrato de sodio (tabla suplementaria S2). En la formulación de BK-AU, la concentración de urea está dentro de la primera porción del 20% del rango fisiológico normal, que es bastante menor que el valor medio. Las concentraciones de ácido úrico y creatinina también son inferiores a la media, es decir, 13,5% y 33,5% de porción, respectivamente., La diferencia en la posición de la banda se debe a las diferentes proporciones de estos componentes en relación entre sí, de modo que la banda superpuesta se desplaza ligeramente en la ubicación. Otra diferencia en el espectro de BK-AU es el pico ubicado en 1246 cm-1 (Fig. 5D). En el espectro urinario humano este pico se encuentra en 1238 cm-1. Desafortunadamente, no está claro si las dos bandas se deben al mismo grupo molecular y hay un cambio de posición, o si las dos bandas se originan de diferentes grupos moleculares. El mismo pico también se observa en CT-AU, como se señaló anteriormente., Además, el problema en la región de 1200-1000 cm−1 visto en CT-AU también se observa en BK-AU. Como se mencionó anteriormente, una combinación perfecta en esta ventana del espectro es casi imposible debido al número de ingredientes necesarios para una UA económica.
la mayor diferencia en el espectro de BK-AU es la absorción relativamente excesiva centrada en ~975 cm-1. Esta banda es una superposición de cinco componentes diferentes en 999, 984, 963, 945 y 909 cm-1 según lo revelado por el segundo perfil derivado del espectro., Un pico similar también se observa en CT-AU a 965 cm-1, pero la amplitud de la banda es mucho menor que la del espectro BK-AU. En el rango entre 940-1020 cm−1, el bicarbonato, el hidrogenofosfato de sodio y la urea tienen absorciones (Fig. 1 y suplemento Fig. S3). Cuando se agregan los espectros de absorción individuales de estos tres compuestos (adición espectral), la amplitud resultante en la región correspondiente es mucho menor que la observada en BK-AU. Esto prueba la formación de un compuesto entre los constituyentes.,
el pico a 866 cm−1 en el espectro urinario está ausente en BK-AU, como fue el caso en CT-AU. La última diferencia entre los dos espectros es de 841 cm-1 en el espectro BK-AU. Este pico es más pronunciado en el espectro BK-AU en relación con el espectro CT-AU y la orina humana. Se debe principalmente a la creatinina (842 cm-1). El sulfato de magnesio también contribuye con una línea de base, dando a la banda su posición final y perfil en la medida en que observamos durante nuestros experimentos., En BK-y CT-AU, el bicarbonato también absorbe a 832 cm-1 que contribuye a la amplitud, pero no cambia la posición del pico de 841 cm−1.
en toda la región de huellas dactilares, los espectros de BK-AU y de orina humana son significativamente diferentes en el nivel de 0.05 según la prueba de Mann-Whitney (Z = -10.8) (tabla suplementaria S5).
comparación de orina artificial en términos de contenido químico
la lista de sustancias químicas utilizadas en las tres UCA es principalmente la misma; sin embargo, la concentración de cada componente es diferente (tabla suplementaria S1)., La figura 6 muestra la cantidad de cada componente en relación con su rango fisiológico normal31. MP-AU se compone de trece componentes, cada uno en el nivel del 50%, que es la media del rango fisiológico normal. Un valor negativo en la figura representa una cantidad insuficiente del producto químico correspondiente. La composición química de la formulación de CT-AU tiene deficiencias. Para empezar, la cantidad de citrato excede el rango normal (~125%). En la misma línea, la cantidad de calcio y cloruro son más que los valores medios, 90% y 64%, respectivamente., Mientras que la creatinina y el fosfato son insuficientes, la cantidad de urea, ácido úrico, amonio, magnesio y sulfato están cerca de los valores mínimos de los rangos normales. En la formulación de BK-AU, la cantidad de sodio, calcio y cloruro son más que los valores medios, 87%, 75% y 76%, respectivamente. Por otro lado, la urea, el ácido úrico, el potasio, el magnesio, el sulfato y el fosfato son bastante inferiores a la media del rango fisiológico normal. Aunque, estos compuestos todavía están dentro del rango normal para un ser humano sano, la cantidad de oxalato es insuficiente.,
cantidad Relativa de común compuestos utilizados en todos los AUs. El eje Horizontal representa el porcentaje de molaridad del rango fisiológico normal para cada compuesto. Todos los valores del rango normal se normalizan de modo que el punto mínimo del rango normal se establece en 0% y el punto máximo del rango normal corresponde a 100%.