La Peste Negra de 1347-1351, causada por la bacteria Yersinia pestis2,3, proporciona uno de los mejores ejemplos históricos de una infección emergente con rápida diseminación y alta mortalidad, reclamando un estimado del 30-50% de la población europea en solo un período de cinco años4. Las discrepancias en las tendencias epidemiológicas entre la enfermedad medieval y las infecciones modernas de Y. pestis han encendido la controversia sobre el agente etiológico de la pandemia5,6., Aunque las investigaciones de ADN antiguo han implicado fuertemente a Y. pestis2, 3 en la pandemia antigua, los cambios genéticos en la bacteria pueden ser parcialmente responsables de las diferencias en la manifestación y gravedad de la enfermedad. Para comprender la evolución del organismo es necesario caracterizar los cambios genéticos implicados en su transformación de un patógeno silvestre a uno capaz de una infección humana pandémica en la escala de la Peste Negra, y determinar su relación con las cepas actualmente circulantes., Aquí Comenzamos esta discusión presentando el primer borrador de la secuencia del genoma del patógeno Antiguo.
Y. pestis es un descendiente recientemente evolucionado del bacillus Yersinia pseudotuberculosis7, que en el curso de su evolución adquirió dos plásmidos adicionales (pMT1 y pPCP1) que le proporcionan mecanismos especializados para infiltrar huéspedes mamíferos. Para investigar los posibles cambios evolutivos en uno de estos plásmidos, se informó sobre el cribado de 46 dientes y 53 huesos de la colección East Smithfield de Londres, Inglaterra para la presencia de la Y., ppcp1 específico de pestis (ref. 3). Los datos históricos indican que el cementerio de East Smithfield se estableció a finales de 1348 o principios de 1349 específicamente para el entierro de víctimas de la muerte Negra8 (Figuras suplementarias 1 y 2), lo que hace que la colección sea adecuada para investigaciones genéticas de la antigua Y. pestis. Los datos de la secuencia de ADN de cinco dientes obtenidos a través de la captura molecular del pPCP1 específico de Y. pestis completo revelaron un patrón de daño de C A T característico de la auténtica DNA9 Antigua endógena, y el ensamblaje de las lecturas agrupadas de Illumina permitió la reconstrucción del 98,68% de las 9.,Plásmido de 6-kilobase con un mínimo de doble cobertura 3.
para evaluar la idoneidad de los métodos basados en la captura para reconstruir el genoma Antiguo completo, se utilizaron múltiples extractos de ADN de raíces y coronas provenientes de cuatro de los cinco dientes que produjeron la cobertura más alta de ppcp13 para el enriquecimiento basado en matrices (Agilent) y la secuenciación posterior de alto rendimiento en la plataforma Illumina GAII 10. La eliminación de moléculas duplicadas y posterior filtrado produjo un total de 2.366.647 lecturas cromosómicas de alta calidad (Tabla suplementaria 1a, b) con una longitud promedio de fragmento de 55.,53 pares de bases (suplemento Fig. 4), que es típico del ADN antiguo. Las estimaciones de cobertura arrojaron un promedio de 28,2 lecturas por sitio para el cromosoma, Y 35,2 y 31,2 para los plásmidos pCD1 y pMT1, respectivamente (Fig. 1a, c, D y cuadro complementario 1b, c). La cobertura fue predeciblemente baja para pPCP1 (Fig. 1e) porque las sondas específicas de este plásmido no fueron incluidas en los arrays. Cobertura correlacionada con el contenido de CG (suplemento Fig. 6), una tendencia observada previamente para los datos de secuencias de alto rendimiento11., La cobertura en cada mitad del cromosoma fue desigual debido a las diferencias en la profundidad de secuenciación entre los dos arrays, con 36.46 y 22.41 lecturas promedio por sitio para el array 1 y el array 2, respectivamente. Aunque una mayor profundidad contribuyó a un mayor promedio de lecturas por sitio, no aumentó la cobertura general, con ambas matrices cubriendo el 93,48% de las regiones objetivo con un mínimo de una cobertura doble (tabla suplementaria 1b)., Esto indica que nuestro procedimiento de captura recuperó con éxito moléculas de plantilla de todas las regiones genómicas accesibles a través de este método, y que una secuenciación más profunda no daría como resultado datos adicionales para regiones de plantilla de CO92 no cubiertas en nuestro conjunto de datos.
a, c–e, la Cobertura de las parcelas para el cromosoma (a) y los plásmidos pMT1 (c), pCD1 (d) y pPCP (e). Cobertura en azul, contenido de GC en verde., Las líneas de escala indican 10-, 20-, 30-, 40- y 50 veces la cobertura y 10%, 20%, 30%, 40% y 50% de contenido de GC. Para los plásmidos, el rojo corresponde a las regiones codificantes, el amarillo a los elementos móviles. El cromosoma se muestra la mediana de la cobertura por gen. Los plásmidos muestran cada sitio trazado. Las distribuciones de cobertura para los plásmidos se muestran en la Fig. 5. b, Las distribuciones muestran la cobertura cromosómica de la matriz 1 (Azul) y la matriz 2 (roja), lo que indica que la secuenciación más profunda aumenta el número de lecturas por sitio, pero no influye sustancialmente en la cobertura general.,
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la arquitectura del Genoma varía ampliamente entre los existentes Y. pestis strains12. Para extrapolar el orden de los genes en nuestro genoma Antiguo, analizamos las lecturas que se asignan a la referencia de CO92 para todos los extractos derivados de un solo individuo que produjo la cobertura más alta (individuo 8291). A pesar de la corta longitud de lectura de nuestras secuencias antiguas y la naturaleza altamente repetitiva del genoma de Y. pestis, se extrajeron 2.221 contigs correspondientes a CO92, que comprenden un total de 4.367.867 bp., Para identificar regiones potenciales del genoma antiguo que son arquitectónicamente distintas del CO92, todas las lecturas que no se corresponden con la referencia al CO92 fueron consideradas a su vez para la construcción de contig. Después de filtrar para una longitud mínima de 500 bp, 2,134 contigs permanecieron comprendiendo 4,013,009 bp, de los cuales 30,959 provenían de lecturas no mapeadas. La búsqueda convencional de explosiones consultada contra el genoma de CO92 identificó coincidencias para 2.105 contigs. Se identificó evidencia de arquitectura alterada en 10 contiguos (tabla suplementaria 2). Un ejemplo de tal variante estructural se muestra en la Fig., 2, donde el ensamblaje guiado por referencia que incorpora lecturas no mapeadas para abarcar el punto de interrupción valida su reconstrucción. Esta orientación genética específica se encuentra solo en las cepas de Y. pseudotuberculosis y Y. pestis Mictrotus 91001, Angola, Pestoides F y B42003004, que son ancestrales a todas las cepas de Y. pestis comúnmente asociadas con infecciones humanas (cepas 1 y 2 13,14). Además, las discrepancias en la disposición de esta región en las cepas modernas de Y. pestis de la rama 1 y la rama 2 indican que los reordenamientos ocurrieron como eventos separados en diferentes linajes.,
Las lecturas mapeadas en las posiciones a (azul) y B (verde) están separadas por 231 kb en el genoma linealizado de CO92. La secuencia adyacente es de alta cobertura, aunque solo se muestra 18× y 20× debido a las restricciones de espacio (negro) para A y B, respectivamente. La variante estructural fue ensamblada usando lecturas que no correspondían al CO92 (rojo)., Su posición se muestra en el cromosoma linearizado Microtus 91001 donde el contig de 9.096 bp mapea con 100% de identidad.
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las diferencias de nucleótidos simples entre nuestro genoma antiguo y la referencia de CO92 sorprendentemente consistieron en solo 97 posiciones cromosómicas, y 2 y 4 posiciones en los plásmidos pCD1 y pMT1, respectivamente (tabla suplementaria 3), lo que indica una estrecha conservación genética en este organismo durante los últimos 660 años. Veintisiete de estas posiciones no fueron reportadas en un análisis previo de Y existente., pestis diversity14 (cuadros complementarios 3 y 4). La comparación de nuestro genoma antiguo con su ancestro Y. pseudotuberculosis reveló que la secuencia medieval contenía el nucleótido ancestral para las 97 posiciones, lo que indica que no posee ninguna posición derivada ausente en otras cepas de Y. pestis. Dos diferencias cromosómicas notificadas3 no estaban presentes en nuestros datos de secuencias genómicas, lo que sugiere que probablemente se derivaron de citosinas desaminadas que se habrían eliminado en la investigación actual a través del tratamiento con uracilo-ADN-glicosilasa antes de la captura del array.,
para situar nuestro genoma antiguo en un contexto filogenético, caracterizamos las 1.694 posiciones filogenéticamente informativas14 previamente identificadas (tabla suplementaria 4), y comparamos las de nuestro Organismo antiguo con los datos agregados de base de la llamada para 17 genomas de Y. pestis disponibles públicamente y la ancestral pseudotuberculosis de Y.. Cuando se consideran por separado, las secuencias de tres de las cuatro víctimas caen solo dos sustituciones de la raíz de todas las cepas patógenas humanas existentes de Y. pestis (Fig. 3a), y muestran una relación más cercana a la rama 1 Y., pestis que a la rama 2; sin embargo, una de las cuatro víctimas (individuo 6330) estaba infectada con una cepa que contenía tres posiciones derivadas adicionales observadas en todos los otros genomas de la rama 114. Esto sugiere la presencia de múltiples cepas en la pandemia de Londres 1348-1350 o cambios microevolutivos acumulados en una cepa, que se sabe que ocurren en brotes de enfermedad15. Soporte adicional para Y., la microevolución de pestis se indica por la presencia de varias posiciones variantes para las cuales los datos de secuencia de un individuo muestran dos nucleótidos diferentes a frecuencias comparables (tabla suplementaria 5). La posición 2896636, por ejemplo, es una posición polimórfica conocida en las poblaciones existentes de Y. pestis14, y esta posición muestra el estado derivado fijo en un individuo (6330) y el estado polimórfico en otro (individuo 8291) con una cobertura mínima de cinco veces (Fig.suplementaria. 7). Esto proporciona un ejemplo notable de microevolución capturada durante una pandemia histórica., Las posiciones de varianza restantes no han cambiado en los 18 genomas de Yersinia existentes, por lo que pueden ser únicas del organismo antiguo y son, por lo tanto, de mayor interés. El muestreo adicional de genomas antiguos ayudará a determinar la frecuencia de estas mutaciones en cepas co-circulantes de Y. pestis, y aclarará la aparición de cepas de la rama 2 que aún no se han reportado en muestras antiguas.
a, Red mediana de Y. pestis antiguo y moderno basada en 1.694 posiciones variantes en genomas modernos14. Círculos de colores representan diferentes clados como se define en ref. 13. Los círculos grises representan nodos hipotéticos. B, árbol filogenético usando 1.694 posiciones variables. Los intervalos de tiempo de divergencia se muestran en años calendario, con soporte de Bootstrap de unión vecina (itálica azul) y probabilidad posterior Bayesiana (azul). Cuadro gris indica cepas patógenas humanas conocidas., A, NZ ACNQ01000; Nepal516, NC 008149; KIM10, NC 004088; B, NZ AAYT01000; C, NZ ABAT01000; D, NZ ACNS01000; E, NZ AAYS01000; F, NZ AAOS02000; CO92, NC 003143; G, NZ ABCD01000; H, NZ AAYV01000; I, NC 014029; J, NZ AAYR01000; Antiqua, NC 008150. c, Geographical origin of genome sequences used in a and b. d, Geographical spread of the Black Death from infection routes reported in ref. 4.,
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las topologías de árbol consistentes se produjeron utilizando varios métodos de construcción y todos los nodos principales fueron compatibles con valores de probabilidad posterior (pp) de >0.96 y valores de bootstrap > div > 90 (fig. 3B Y Figuras complementarias 8 y 9). Los árboles colocan la secuencia de East Smithfield cerca del nodo ancestral de todas las cepas patógenas humanas existentes de Y. pestis (solo dos diferencias en 1.694 posiciones) y en la base de la rama 1 (Fig. 3b)., Una fecha segura para el sitio de East Smithfield de 1348-1350 nos permitió asignar una calibración de punta a la secuencia Antigua y, por lo tanto, fechar el tiempo de divergencia de los genomas modernos y el genoma de East Smithfield utilizando un enfoque Bayesiano. Las estimaciones temporales indican que todos Y., pestis comúnmente asociado con la infección humana compartió un ancestro común en algún momento entre 668 y 729 años atrás (1282-1343 D.C., 95% de densidad de probabilidad más alta, HPD), abarcando un intervalo de tiempo mucho menor que las estimaciones publicadas recientemente14 e indicando además que todos los aislados de Rama 1 y rama 2 actualmente circulantes emergieron durante el siglo XIII como mínimo (Fig. 3b), potencialmente procedente de una fuente de Asia oriental, como se ha sugerido previamente14., Esto implica que la peste medieval fue el principal evento histórico que introdujo a las poblaciones humanas al antepasado de todas las cepas patógenas conocidas de Y. pestis. Esto cuestiona aún más la etiología de la plaga de Justiniano del siglo VI al VIII, popularmente asumida como resultado del mismo patógeno: nuestras estimaciones temporales implican que la pandemia fue causada por una variante de Y. pestis que es distinta de todas las cepas actualmente circulantes comúnmente asociadas con infecciones humanas, o fue otra enfermedad en conjunto.
aunque nuestro enfoque de usar una y existente., pestis plantilla de referencia para el cebo de diseño impide nuestra capacidad para identificar las regiones genómicas que puede haber estado presente en el organismo antiguo y se perdieron posteriormente en CO92 de la genómica, las comparaciones de nuestros antiguos de la secuencia en contra de su más cercano exogrupos puede dar información valiosa sobre la Y. pestis evolución. La cepa Microtus 91001 es el pariente más cercano de las ramas 1 y 2 confirmado como no patógeno para los humanos16, por lo que los cambios genéticos pueden representar contribuciones a la adaptación del patógeno a un huésped humano., Las comparaciones con este grupo externo revelaron 113 cambios (tabla suplementaria 6a, b), muchos de los cuales se encuentran en genes que afectan a funciones asociadas a la virulencia como la formación de biopelículas (hmsT), la adquisición de hierro (iucD) o la adaptación al entorno intracelular (phoP). Del mismo modo, aunque su potencial de virulencia en humanos aún no se ha confirmado hasta nuestro conocimiento, Y. pestis b42003004 aislado de una población de marmot China17 se ha identificado como la cepa más cercana al nodo ancestral de toda Y., pestis comúnmente asociado con la peste humana, y por lo tanto puede proporcionar información clave sobre la evolución del organismo. La comparación del genoma completo con la secuencia de East Smithfield reveló solo ocho diferencias de nucleótido único (tabla suplementaria 6c), seis de las cuales resultan en cambios no sinónimos (tabla suplementaria 6d). Aunque estas diferencias probablemente no afecten a la virulencia, la influencia de la pérdida, ganancia de genes o reordenamientos genéticos,todos los cuales están bien documentados en Y. pestis12, 18, aún no se ha determinado., En términos evolutivos más recientes, se encontraron diferencias de un solo nucleótido en varios genes asociados a patogenicidad conocidos entre nuestro genoma antiguo y la secuencia de referencia de CO92 (tabla suplementaria 3), que pueden representar adaptaciones adicionales a los huéspedes humanos.,
a través del enriquecimiento por captura de ADN junto con la secuenciación de ADN de alto rendimiento dirigida, hemos reconstruido un borrador del genoma para lo que es posiblemente el patógeno humano más devastador de la historia, y revelamos que la plaga medieval del siglo XIV fue probablemente responsable de su introducción y distribución generalizada en las poblaciones humanas. Esto indica que el patógeno implicado en la Peste Negra tiene parientes cercanos en el siglo XXI que son tanto endémicos como emergentes19., La introducción de nuevos patógenos en las poblaciones a menudo se asocia con un aumento de la incidencia y gravedad de la enfermedad20 y, aunque los mecanismos que rigen este fenómeno son complejos21, los datos genéticos de antiguas enfermedades infecciosas aportarán una contribución inestimable a nuestra comprensión de la coevolución huésped–patógeno. La Peste Negra es un ejemplo seminal de una infección emergente, que viaja por Europa y se cobra la vida de unos 30 millones de personas en solo 5 años, lo que es mucho más rápido que las tasas contemporáneas de infección y diseminación por Peste Bubónica o neumónica22.7,8., Sin embargo, aunque ninguna cepa de Y. pestis posee el mismo perfil genético que nuestro antiguo Organismo, nuestros datos sugieren que pocos cambios en los genes asociados a la virulencia conocidos se han acumulado en los 660 años de evolución del organismo como patógeno humano, lo que sugiere además que su aumento de virulencia percibido en la historia23 puede no deberse a nuevas mutaciones de punto fijo detectables a través del enfoque analítico descrito aquí., En nuestra resolución actual, postulamos que los cambios moleculares en los patógenos son solo un componente de una constelación de factores que contribuyen a cambiar la prevalencia y gravedad de las enfermedades infecciosas, donde la genética de la población hospedera24, el climato25, la dinámica de los vectores26, las condiciones sociales27 y las interacciones sinérgicas con enfermedades concurrentes28 deben ser los principales en las discusiones sobre la susceptibilidad de la población a las enfermedades infecciosas y las relaciones huésped–patógeno con referencia a las infecciones por Y. pestis.