diagnóstico etiológico de infecciones neumocócicas
los neumococos son una causa principal de neumonía y una causa importante de meningitis, bacteremia, sepsis, otitis media, rinitis y sinusitis . Clásicamente, el diagnóstico etiológico de estas infecciones se ha hecho mediante el cultivo del microorganismo a partir de muestras de pacientes adecuadas.,
la identificación de Streptococcus pneumoniae a partir del cultivo depende de la observación de las características morfológicas tanto de la bacteria como de las colonias, así como de otras tres características fenotípicas principales, incluyendo la negatividad de la catalasa, la solubilidad biliar y la susceptibilidad a la optoquina. La susceptibilidad a la optoquina es un pilar para la identificación de neumococos debido a la facilidad de realización de la prueba, cuya base es la inhibición de la optoquina de la ATPasa neumocócica, una característica que generalmente no es compartida por otros viridianos estreptococos ., Sin embargo, la aparición de variantes resistentes a la optoquina ha puesto en tela de juicio la validez de utilizar este único test para la presunta identificación de neumococos. La especificidad de la prueba de solubilidad biliar sigue siendo alta, y es la prueba única más precisa para la identificación de S. pneumoniae . El fenotipo de solubilidad biliar se debe a la activación de la principal enzima autolítica (una n-acetilmuramil-L-alanina amidasa codificada por el gen lytA), que también se puede lograr mediante desoxicolato de sodio., Se encontró que algunos aislados neumocócicos eran insolubles en desoxicolato de sodio, que se ha atribuido a alteraciones en la autolisina mayor , pero la abrumadora mayoría de los neumococos siguen siendo solubles en bilis, por lo que es una prueba extremadamente precisa para la identificación neumocócica.
la espectrometría de masas por desorción láser asistida por Matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) está trayendo un cambio fundamental en la identificación rutinaria de patógenos microbianos en los laboratorios de Microbiología Clínica ., A pesar del éxito de MALDI-TOF en simplificar y proporcionar una identificación consistentemente precisa, incluso con organismos previamente problemáticos, el éxito de los sistemas actualmente disponibles en la identificación de S. pneumoniae ha sido pobre . El perfil de masa de los sistemas MALDI-TOF desplegados en los laboratorios de microbiología clínica es generado principalmente por proteínas ribosómicas que facilitan la alineación con las clasificaciones taxonómicas actuales. Sin Embargo, S., pneumoniae es un clado dentro del grupo de estreptococos mitis evolutivamente relacionados, con el que puede compartir muchas características, incluyendo proteínas ribosómicas similares . Por lo tanto, la distinción por MALDI-TOF entre S. pneumoniae y sus parientes menos patógenos del grupo mitis es difícil. Recientemente, se argumentó que hacer esta distinción podría ser posible utilizando un análisis más detallado de los perfiles de masa , y esto fue seguido por una publicación que informa el éxito de un sistema disponible comercialmente en la distinción de S. pneumoniae de otras especies del grupo mitis ., Estos avances alentadores pueden simplificar la identificación rutinaria de S. pneumoniae en los laboratorios de Microbiología Clínica.
la capacidad de producir un polisacárido capsular (CPS) también es un sello distintivo de los neumococos. La cápsula se puede visualizar mediante varias técnicas de microscopía, pero en neumococos la presencia de un SPC se detecta generalmente utilizando sueros específicos . El Statens Serum Institut de Copenhague, Dinamarca, es la fuente más frecuente de sueros para identificar cápsulas neumocócicas., Proporcionan un «omni-suero» que reacciona con todas las cápsulas neumocócicas conocidas y que puede ser útil en la identificación de neumococos, así como sueros específicos que reaccionan solo con polisacáridos particulares o grupos de polisacáridos . Los neumococos no encapsulados son conocidos y frecuentemente se han asociado con brotes de conjuntivitis . Sin embargo, dado que la producción de un SPC es un rasgo definitorio de los neumococos, estos han sido sometidos a pruebas particularmente estrictas para confirmar su identificación como S. pneumoniae .,
la identificación del SPC neumocócico mediante el efecto de Quellung o prueba de Neufeld, utilizando sueros específicos de conejo, es una técnica probada que se ha utilizado desde los primeros días del serotipado neumocócico . Sin embargo, esta técnica requiere una experiencia específica, por lo que más recientemente, el Statens Serum Institut ha puesto a disposición una prueba de aglutinación en látex, que permite un procedimiento más simplificado para el serotipado de neumococos . Para simplificar aún más este proceso, se han desarrollado varios esquemas de «serotipado genético» para identificar características particulares de los loci de cps., A pesar de la multitud de enfoques, los más ampliamente adoptados se basan en la amplificación por PCR de genes específicos de serogrupo o serotipo . De hecho, se han desarrollado procedimientos de PCR tanto convencionales como en tiempo real, y se ha propuesto una gran diversidad de esquemas para acomodar las diferencias en la prevalencia de los diversos serotipos en diferentes regiones geográficas ., Aunque el serotipado genético ha hecho que el serotipado esté disponible para un mayor número de laboratorios y ha ayudado a aclarar reacciones poco claras, los métodos fenotípicos siguen siendo el estándar de oro para el serotipado neumocócico , y reflejando esto, también se han desarrollado enfoques híbridos que involucran tanto PCR como anticuerpos monoclonales ., Tal vez los ejemplos más claros de esto son aislados en los que el locus capsular contiene mutaciones puntuales o inserciones que conducen a la ausencia de expresión de un SPC (van der Linden y Ramirez, Datos inéditos) pero a los que se les asignaría un serotipo de acuerdo con esquemas de serotipado genético.
las nuevas metodologías basadas en la detección de componentes microbianos son cada vez más importantes en el diagnóstico de infecciones neumocócicas ., La detección inmunocromatográfica de polisacárido C (ácido teicoico) en orina ha mejorado mucho el diagnóstico de Neumonía neumocócica en adultos, aunque en niños la alta frecuencia de transporte neumocócico resulta en una especificidad inadecuada de la prueba . La prueba también se valida para su uso en LCR, lo que lleva a un mejor diagnóstico etiológico de la meningitis ., Cada vez hay más evidencia de la utilidad del test en la detección de neumococos en líquido pleural tanto en niños como en adultos , pero hay mucha menos información sobre su uso en lavado broncoalveolar , en aspirados nasofaríngeos o en medios hemocultivos , donde puede ser útil en la detección de neumococos que ya no son viables.
más recientemente, la detección de ADN neumocócico se ha utilizado para el diagnóstico. Para ello se ha utilizado la amplificación por PCR de fragmentos de genes específicos de S. pneumoniae, como lytA, ply, psaA, cpsA (wzg) o spn9802., Las metodologías de PCR en tiempo Real han demostrado ser más sensibles que la PCR convencional, pero también se desarrollaron otras variaciones, incluida la detección de los productos de PCR con perlas, microarrays o fraccionamiento de tamaño . La combinación de la amplificación del ADN para la identificación con los enfoques de serotipado genético discutidos anteriormente permite la identificación del serotipo de la cepa sin la necesidad de cultivo . El uso de estas metodologías en derrames paraneumónicos o empiema está bien documentado y aumenta en gran medida el rendimiento diagnóstico etiológico sobre el cultivo .,
existe un gran interés en el uso de estas metodologías para detectar neumococos en la sangre para casos de neumonía tanto en niños como en adultos . Sin embargo, la alta tasa de transporte de neumococos en niños podría ser un factor de confusión importante al detectar la circulación del ADN neumocócico en portadores sanos . Dos estudios han abordado específicamente esta cuestión, con resultados contradictorios . Otros estudios indican que la carga neumocócica estimada en sangre está correlacionada con la gravedad de la enfermedad y potencialmente podría ser utilizada para distinguir entre colonización e infección .,
un enfoque similar se ha defendido en el caso de las muestras respiratorias que están más disponibles, como el esputo. El valor del esputo en el diagnóstico de neumonía ha sido ampliamente discutido , incluso en el contexto de los métodos de cultivo convencionales. Si bien se puede argumentar que la ausencia de neumococos podría excluirlo potencialmente como agente etiológico, hipótesis que ciertamente justifica estudios adicionales, su detección podría atribuirse a la infección o al transporte asintomático ., En adultos, la cuantificación de neumococos o ADN neumocócico en esputo se ha propuesto para distinguir entre colonización y enfermedad , pero esto puede complicarse por la variabilidad de los ensayos y la falta de criterios claros para definir valores de corte, incluso en muestras de buena calidad . En los niños, se han sugerido enfoques similares, pero el valor diagnóstico de este enfoque se cuestiona aún más por el hecho de que muchos niños son colonizados por neumococos a densidades muy altas., El monitoreo de dos marcadores clave del huésped, la proteína C reactiva y la procalcitonina, parece aumentar la especificidad de los ensayos de PCR en el diagnóstico de infección neumocócica del tracto respiratorio inferior . A pesar de estas incertidumbres, varios ensayos disponibles comercialmente ya ofrecen la detección de ADN neumocócico con fines diagnósticos .,
aunque los métodos microbiológicos tradicionales, incluidos los métodos más recientes de detección de antígenos, seguirán siendo el pilar en muchos laboratorios para el diagnóstico de infecciones neumocócicas, los métodos moleculares más nuevos sin duda serán cada vez más importantes. El aumento de la adopción de pruebas moleculares dependerá de que se aclare la relevancia para identificar la infección de detectar evidencia de la presencia de productos bacterianos en muestras humanas. Esto será particularmente complicado para las muestras respiratorias, donde el debate continúa, incluso para los enfoques más tradicionales., Dada nuestra creciente comprensión de las relaciones entre múltiples patógenos en el tracto respiratorio superior que pueden condicionar su capacidad para causar infecciones, los enfoques moleculares que detectan múltiples patógenos sin duda serán cada vez más importantes en el diagnóstico etiológico de las infecciones del tracto respiratorio .