Este material se acompaña de una presentación sobre la estructura de las proteínas y los principios detrás de las muestras de desnaturalización y electroforesis en gel discontinuo.
la separación de macromoléculas en un campo eléctrico se denomina electroforesis. Un método muy común para separar proteínas por electroforesis utiliza un gel de poliacrilamida discontinua como medio de soporte y dodecil sulfato de sodio (SDS) para desnaturalizar las proteínas. El método se llama electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)., El sistema más comúnmente utilizado también se llama el método de Laemmli en honor a Laemmli del Reino Unido, quien fue el PRIMERO en publicar un artículo empleando SDS-PAGE en un estudio científico.
SDS (también llamado lauril sulfato) es un detergente aniónico, lo que significa que cuando se disuelve sus moléculas tienen una carga negativa neta dentro de un amplio rango de pH. Una cadena polipeptídica une cantidades de SDS en proporción a su masa molecular relativa. Las cargas negativas en el SDS destruyen la mayor parte de la compleja estructura de las proteínas, y son fuertemente atraídas hacia un ánodo (electrodo cargado positivamente) en un campo eléctrico.,
Los geles de poliacrilamida impiden que las moléculas más grandes migren tan rápido como las moléculas más pequeñas. Debido a que la relación carga-masa es casi la misma entre los polipéptidos desnaturalizados SDS, la separación final de las proteínas depende casi por completo de las diferencias en la masa molecular relativa de los polipéptidos. En un gel de densidad uniforme, la distancia relativa de migración de una proteína (Rf, la f como subíndice) es negativamente proporcional al logaritmo de su masa., Si las proteínas de masa conocida se ejecutan simultáneamente con las incógnitas, la relación entre la Rf y la masa puede ser trazada, y las masas de proteínas desconocidas estimadas.
La separación de proteínas por SDS-PAGE se puede utilizar para estimar la masa molecular relativa, para determinar la abundancia relativa de proteínas principales en una muestra, y para determinar la distribución de proteínas entre fracciones. Se puede evaluar la pureza de las muestras de proteínas y se puede seguir el progreso de un procedimiento de fraccionamiento o purificación., Se pueden usar diferentes métodos de tinción para detectar proteínas raras y aprender algo sobre sus propiedades bioquímicas. Técnicas especializadas como Western blotting, electroforesis bidimensional y mapeo de péptidos pueden ser utilizadas para detectar productos genéticos extremadamente escasos, encontrar similitudes entre ellos, y para detectar y separar isoenzimas de proteínas.
masa Molecular versus peso molecular
la masa Molecular (Símbolo m) Se expresa en Daltons (Da). Un Dalton se define como 1/12 la masa de carbono 12., La mayoría de las macromoléculas son lo suficientemente grandes como para usar el kiloDalton (kDa) para describir la masa molecular. El peso Molecular no es lo mismo que la masa molecular. También se conoce como masa molecular relativa (símbolo Mr, donde r es un subíndice). El peso Molecular se define como la relación entre la masa de una macromolécula y 1/12 de la masa de un átomo de carbono 12. Es una cantidad adimensional.
Cuando la literatura da una masa en Da O kDa se refiere a la masa molecular. Es incorrecto expresar el peso molecular (masa molecular relativa) en Daltons., Sin embargo, encontrará el término peso molecular usado con daltons o kiloDaltons en alguna literatura, a menudo usando la abreviatura MW para peso molecular.
geles de poliacrilamida para SDS-PAGE
se han desarrollado muchos sistemas para electroforesis de proteínas, y el aparato utilizado para SDS-PAGE varía ampliamente. La metodología utilizada en estas páginas emplea el método Laemmli. La referencia al método Laemmli en una sección de materiales y métodos elimina la necesidad de describir los tampones, la fundición de geles, aparatos, etc., A menos que el artículo emplee alguna modificación al método, los únicos detalles de SDS-PAGE que deben ser reportados en una sección de métodos son el porcentaje total de acrilamida (%T) en un gel, el porcentaje relativo y el tipo de reticulador (%C), y tal vez una referencia a las dimensiones del gel. Utilizamos un sistema «mini-gel», con 3 casetes de gel de 1/4″ x 4″.
SDS-PAGE se puede realizar en geles pre-fundidos, ahorrando el problema y el peligro de trabajar con acrilamida. La siguiente descripción se aplica a los aparatos de fundición y funcionamiento hechos en la tienda que son mucho más baratos que los equipos disponibles comercialmente., Además de la rentabilidad, una ventaja de hacer sus propios geles la primera vez es una comprensión más profunda del proceso.
independientemente del sistema, la preparación requiere fundir dos capas diferentes de acrilamida entre placas de vidrio. La capa inferior (separando, o resolviendo, gel) es responsable de separar realmente polipéptidos por tamaño. La capa superior (gel de apilamiento) incluye los pocillos de muestra. Está diseñado para barrer las proteínas en una muestra entre dos límites móviles para que se comprimen (apilan) en capas delgadas micrométricas cuando alcanzan el gel de separación.,