Frontiers in Veterinary Science

Introducción

los invertebrados incluyen aproximadamente un millón de especies animales mantenidas tanto en instituciones zoológicas como en hogares donde se crían a mano como mascotas exóticas (1). Los gasterópodos comprenden cerca de 60.000 especies de moluscos acuáticos y terrestres, principalmente caracoles y babosas (1). El caracol gigante africano de tierra (Achatina fulica, syn., Lissachatina fulica) es originaria de África Oriental, sin embargo es una especie invasora muy extendida en Asia, Oceanía y más recientemente en América, donde se ha introducido accidentalmente o a propósito como fuente de alimento y como mascota. Su liberación en ecosistemas naturales, áreas agrícolas y urbanas ha resultado en amenazas ecológicas, de salud y agrícolas (2, 3). El caracol terrestre africano gigante es un huésped intermedio para varios parásitos incluyendo Aelurostrongylus abstrusus, Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus costaricensis, Schistosoma mansoni, Hymenolepis spp.,, and Fasciola hepatica (4, 5). Todos los helmintos anteriores, con la excepción de A. abstrusus, son capaces de causar enfermedades graves en los seres humanos. Específicamente, el caracol terrestre gigante africano es el principal gasterópodo responsable de la propagación mundial de A. cantonensis que causa meningoencefalitis eosinofílica humana en Asia y América (2, 6). Los factores de riesgo para la infección en humanos, mascotas y Vida silvestre con esos parásitos helmintos incluyen la ingestión de caracoles o babosas infectados crudos o poco cocidos, o alimentos contaminados por el limo de caracoles o babosas infectados (4, 5, 7, 8).,

aunque los caracoles terrestres gigantes africanos se encuentran entre los caracoles más populares mantenidos como mascotas, y su popularidad mundial como mascotas exóticas está creciendo rápidamente, solo se han llevado a cabo unas pocas encuestas sobre la aparición de sus parásitos en condiciones naturales (2, 6, 9-11). El objetivo de esta encuesta fue investigar la presencia de parásitos en caracoles terrestres africanos Gigantes criados como mascotas en el sur de Italia.,

materiales y métodos

Datos generales

en agosto de 2018, se investigaron tres piscinas de muestras fecales frescas obtenidas de un total de 60 caracoles terrestres africanos Gigantes, mantenidos en tres colecciones privadas diferentes ubicadas en Pozzuoli, Caserta y Nápoles (Italia), para detectar parásitos. De cada localidad se obtuvo una piscina de heces de 20 caracoles individuales cada uno. Los caracoles incluidos en esta encuesta tenían una mediana de edad de 1,6 años que oscilaba entre 0,2 y 2 años y no habían recibido ningún tratamiento antiparasitario previo., Los caracoles fueron alimentados con verduras y frutas frescas; además, un suplemento de calcio en polvo (Calcium, Exo Terra, Hagen Deutschland GmbH & Co. KG, Holm, Alemania) se proporcionó dos veces por semana. Todos los animales fueron criados en Italia, de propiedad privada y mantenidos como mascotas en cuatro terrarios interiores de 60 × 30 × 45 cm de tamaño, en grupos de 10-20 animales (2 grupos de 20 caracoles en Pozzuoli y Caserta y 2 grupos de 10 caracoles cada uno en Nápoles)., Se utilizó como sustrato un suelo de turba orgánica (Organic Coco-Peat Soil, e-Coco Products, Gloucestershire, Reino Unido), previamente tratado térmicamente (100°C durante 30 min) y luego libre de parásitos e insectos.

Procedimientos de diagnóstico

inicialmente se obtuvieron veinte gramos de heces frescas de cada uno de los cuatro terrarios., Cuando las heces agrupadas analizadas por frotis fresco, flotación y prueba de Baermann mostraron positividad a nematodos rabdíticos, dos caracoles de cada terrario positivo fueron alojados individualmente en una caja de plástico estéril, y sus heces fueron recolectadas, inmediatamente después de la defecación, en un tubo de plástico estéril de 50 ml. El examen coprológico de muestras agrupadas e individuales incluyó frotis fresco, flotación centrífuga (2 g de heces para cada prueba) utilizando una solución de azúcar y formaldehído (gravedad específica 1,27) y prueba de Baermann (10 g de heces para cada prueba)., Además, el moco obtenido durante el examen de frotis fresco fue analizado bajo un microscopio de luz. Debido a que las formas larvarias de varias especies de helmintos pueden enquistarse dentro del músculo del pie de los caracoles, el examen histológico de las muestras de biopsia recolectadas de las áreas anterior y posterior del músculo del pie se realizó en 30 caracoles, anestesiados con la técnica descrita por Giannelli et al. (12) y Gilbertson y Wyatt (13)., Las muestras de biopsia se fijaron en formalina tamponada con fosfato neutro al 10% y se procesaron por métodos rutinarios en bloques de parafina que se cortaron en secciones de 3 µm de espesor y se teñieron con hematoxilina y eosina. El estudio se realizó con el permiso de la práctica donde se llevó a cabo y con el consentimiento informado firmado y escrito del propietario.

identificación morfológica

los montajes temporales fueron realizados por nematodos matadores de calor en portaobjetos de vidrio en una gota de agua, después de lo cual se aplicó un deslizamiento de cubierta de vidrio., Los nematodos se transfirieron a una gota de agua del grifo en un portaobjetos de vidrio y se colocaron en un calentador (100°C) durante 10 s. estos especímenes se utilizaron para la identificación morfológica. Un microscopio de luz AMPLIVAL, Carl Zeiss Jena, y un Diaplan de Leitz con óptica de Nomarski fueron utilizados para la observación., La identificación morfológica de los nematodos rabdíticos siguió a Andrassy (14) y Andrassy (15) y se basó principalmente en la morfología de la faringe y el estoma, y el sistema reproductivo, principalmente las características de las espículas, el número y la posición de las papilas o la presencia y el tamaño o la forma de la bursa para los machos; y la forma de la cola, la posición de la vulva y la morfología del sistema reproductivo para las hembras. La identificación de las larvas se basó en la forma de la cola.

análisis Molecular

se extrajo ADN de especímenes de nematodos obtenidos de heces fijadas en etanol al 96% recolectado en las tres localidades., Los nematodos se lavaron en agua doble destilada (ddH2O) durante la noche, antes del análisis molecular, para la eliminación completa de los residuos de etanol. Cada nematodo individual se transfirió a un tubo Eppendorf estéril (200 µl) con 20 µl de tampón de extracción (17,7 µl de ddH2O, 2 µl de tampón PCR concentrado de 10×, 0,2 µl de interpolación 20 al 1% y 0,1 µl de proteinasa K). El tampón y los nematodos se congelaron a -20°C durante 20 min, y luego se incubaron inmediatamente a 65°C durante 1 h, seguido de 10 min a 95°C., Los LISADOS se enfriaron en hielo y luego se centrifugaron (2 min, 9.000 g); se utilizó 1 µl de sobrenadante para PCR.

Un fragmento de ADNr que contenía las regiones espaciadoras transcritas internas (ITS1, 5.8 S, ITS2) fue amplificado usando cebadores 18S: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′ (hacia adelante), y 28S: 5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′ (inverso) (16). Un fragmento de ADNr que contiene el gen para 18S ARNr fue amplificado usando cebadores 22F: 5 ‘- TCC AAG GAA GGC AGC AGC GC-3′ (hacia adelante), y 1080JR: 5′- TCC TGG TGG TGC CCT TCC GTC AAT TTC-3’ (inverso) (17). La PCR master mix consistió en: ddH2O, 7.,25µl; tampón de 10 × PCR, 1,25 µl; trifosfatos de desoxinucleósido (dNTPs), 1 µl; 0,75 µl de imprimación hacia adelante y hacia atrás; polimerasa, 0,1 µl; y 1 µl de extracto de ADN. Los perfiles PCR se utilizaron de la siguiente manera: para su 1 ciclo de 94°C durante 7 min seguido de 35 ciclos de 94°C Para 60 s, 50°C Para 60 s y 72°C Para 60 s, y una elongación final a 72°C para 7 min (14); para 18S 1 ciclo de 94°C para 5 min, seguido de 35 ciclos de 94°C Para 60 s, 55°C para 90 s y 72°C para 2 min y una elongación final a 72°C durante 10 min., Los productos PCR fueron secuenciados por GATC Biotech (Alemania) y posteriormente editados y subidos a GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

resultados

la prueba de Baermann reveló la presencia de larvas de nematodos, cuya longitud varió de 170 a 336 µm, en todas las muestras. Se detectaron huevos, larvas y nematodos rabdíticos adultos mediante frotis fresco y métodos de flotación en todas las muestras fecales. Rhabditella axei (Figura 1) se identificó morfológicamente a partir de dos de tres muestras fecales agrupadas e individuales de Pozzuoli y Nápoles. Además, Rhabditis terricola, Cruznema sp.,, y Pristonchus entomophagus se aislaron de una piscina y muestras fecales individuales de Caserta. No se detectaron parásitos en las muestras de biopsia muscular ni en el moco.

Varios tipos morfológicos de rhabditid los nematodos fueron aisladas de caracol heces fija en el 96% de etanol. Las secuencias obtenidas y editadas de ITS y 18S de estos nematodos fueron comparadas (BLAST) con el material en GenBank e identificadas como R. axei (18S parciales, número de adhesión MK124578, similitud 99%), Rh., terricola (parcial 18S e parcial ITS1, número de adhesión MK156052, similitud 100%), p. entomophagus (parcial 18S e parcial ITS1, número de adhesión MK156050, similitud 99%) y Cruznema sp. (parcial 18S y parcial ITS1, número de adhesión MK156051, similitud 96-100%).

discusión

los resultados de este estudio indican que todos los caracoles terrestres africanos Gigantes examinados ponen huevos, larvas y nematodos rabdíticos adultos en las heces, y por lo tanto pueden representar una fuente de infección para otras mascotas y seres humanos. Con el fin de evitar la identificación errónea con Strongyloides sp.,, una especie de nematodo que se asemeja mucho a los rabdítidos y tiene una clara relevancia zoonótica parasitaria (14, 15, 18), el diagnóstico morfológico inicial de los nematodos rabdítidos se confirmó a través de análisis moleculares.

Rhabditidae incluye nematodos saprofíticos de vida libre, ampliamente encontrados en el suelo y restos orgánicos donde se alimentan principalmente de bacterias. Muchas especies de caracoles pueden servir como hospedadores definitivos para los nematodos rabdíticos (14, 15). Sin embargo, varias especies de Rhabditis y Rhabditella se han asociado con vertebrados incluyendo humanos (14, 15, 19-27)., Aunque su presencia puede ser el resultado de la contaminación ambiental, estos nematodos pueden causar enfermedades en muchos animales y seres humanos. Rhabditis elongata, Rh. hominis, y Rh. las larvas usuii se han aislado de heces humanas, orina e Hisopos vaginales (19-21). Sin embargo, no se han notificado muchos casos de infecciones sintomáticas en humanos (21-24). Feng y Li (25) describieron dos casos humanos de infección urinaria por R. axei en China, y Ahn et al. (20) reportaron cinco casos humanos de infección intestinal con Rhabditis sp. in rural school children of South Korea., Del mismo modo, se describieron dos casos de infección intestinal humana por R. axei en China (26), mientras que otro trabajo publicado (21) reportó un caso de infección intestinal en un niño Brasileño de 5 meses que se presentó con fiebre y diarrea acuosa y sanguinolenta; el examen coprológico reveló huevos, larvas y adultos de Rhabditis sp. Meamar et al. (27) describieron la aparición de diarrea acuosa en dos pacientes iraníes con SIDA, asociada a infección intestinal severa por larvas y especímenes adultos de R. axei. Por último, Teschner et al., (24) describieron recientemente un caso de infección del canal auditivo externo en un hombre de 37 años que presentaba otorrenia purulenta de ambos oídos y pérdida auditiva aguda causada por Rabditis sp. En general, Rhabditis spp. se consideran una causa común de otitis externa en el ganado que vive en áreas tropicales (por ejemplo, América del Sur y África), particularmente en animales más viejos, y se han identificado también en pollos, perros y cerdos con diarrea incoercible (18, 28-30). Sin embargo, también se han descrito infecciones asintomáticas y estos nematodos a menudo se consideran pseudoparásitos (28, 29).,

aunque se recuperaron nematodos de vida libre en todas las muestras fecales, no se encontraron muestras en el moco ni en las muestras histológicas. Una posible explicación para este hallazgo es que los nematodos pueden localizarse en diferentes tejidos/órganos de sus huéspedes, dependiendo del tipo de asociación nematodo/molusco huésped (15, 31, 32). Rhabditis spp. completa su ciclo de vida dentro del Caracol, sin dañar a su huésped molusco. Estudios previos sobre los caracoles africanos en libertad (Archachatina spp. y Achatina spp.) reveló que R., axei vive en el tracto gastrointestinal de su huésped caracol donde se completa todo el ciclo de vida del nematodo (31-33).

aunque los caracoles gigantes africanos están listados como huéspedes de R. axei, la presencia de este nematodo se ha reportado solo en unas pocas especies de caracoles gigantes africanos aparte de A. fulica, a saber, Archachatina marginata ovum, Ar. marginata saturalis, y Achatina achatina (31). Por otro lado, P. entomophagus tiene una distribución mundial y se ha asociado principalmente a escarabajos de estiércol pertenecientes a la superfamilia Scarabaeoidea (34, 35), R., terricola se ha encontrado en salamandras (14, 15) y Cruznema spp. en el grillo Gryllodes Laplatae (Orthoptera) (36). En todos los casos, la transmisión del parásito ocurre a través del contacto de los caracoles con el suelo húmedo contaminado que es rico en materia orgánica en descomposición (31, 37). Aunque, en los casos actuales, todos los animales fueron mantenidos en terrarios con un suelo orgánico tratado térmicamente, especulamos que la infección pudo haber ocurrido antes de la compra de los animales en las tiendas de mascotas o en las instalaciones de cría.,

en conclusión, nuestros resultados indican que los caracoles terrestres africanos gigantes como mascotas pueden servir como reservorio de varios nematodos rabdíticos. Esta especie de caracol es una de las más comúnmente mantenidas como mascotas, y por lo tanto a menudo viven cerca de los humanos. Como resultado, la contaminación del medio ambiente doméstico a través de sus heces es posible. Aunque los nematodos parásitos no fueron aislados en este estudio, los caracoles terrestres africanos Gigantes aún deben ser considerados portadores potenciales de nematodos capaces de causar enfermedades oportunistas en humanos., Por lo tanto, destacamos la importancia de continuar la investigación epidemiológica sobre la ocurrencia de nematodos de vida libre y parásitos en caracoles gasterópodos mantenidos en cautiverio, y enfatizamos la necesidad de medidas de control estrictas para reducir el riesgo de infección oportunista con nematodos rabdíticos en los dueños de caracoles de compañía.

contribuciones del autor

Dd’o y MS concibieron y planificaron el análisis. MS y JN llevaron a cabo el análisis. CA ayudó a dar forma a la investigación y editó el manuscrito. Todos los autores aportaron comentarios críticos y contribuyeron al manuscrito final.,

Declaración de conflicto de intereses

los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran ser interpretadas como un potencial conflicto de intereses.