definición de electroforesis en Gel
la electroforesis en Gel es un procedimiento utilizado para separar las moléculas biológicas por tamaño. La separación de estas moléculas se logra colocándolas en un gel con poros pequeños y creando un campo eléctrico a través del gel. Las moléculas se moverán más rápido o más lento en función de su tamaño y carga eléctrica.,
Descripción general de la electroforesis en Gel
el proceso de electroforesis en gel funciona porque las moléculas cargadas negativamente se alejan del polo negativo de la corriente eléctrica y las moléculas más pequeñas se mueven más rápido que las moléculas más grandes. Por lo tanto, se logra una separación de tamaño dentro del grupo de moléculas que corren a través del gel. El gel funciona de manera similar a un tamiz que separa las partículas por tamaño. La electroforesis trabaja para mover las partículas, usando su carga eléctrica inherente, a través del tamiz.,
Cuando los investigadores están tratando de distinguir entre diferentes segmentos de ADN, por ejemplo, el proceso es simple. Las muestras se cargan en los canales al inicio del gel. Cada molécula de ADN tiene la misma carga (-1), porque el ADN está formado por los mismos 4 nucleótidos y siempre lleva una carga ligeramente negativa independientemente de su tamaño. Por lo tanto, cada molécula de ADN tendrá la misma fuerza tirando de él a través del gel.
sin embargo, el tamaño de cada molécula dificulta su progreso a través del gel., Las moléculas grandes golpean partes de la matriz de gel y se ralentizan. Pequeñas moléculas de ADN pueden deslizarse entre los diversos componentes de la matriz del gel, y rápidamente hacer su camino hacia el otro lado del gel. Después de una cierta cantidad de tiempo, las moléculas de ADN teñidas se pueden ver agregándose en diferentes áreas del gel, en función de cuán lejos se movieron durante la electroforesis en gel. Esto permite a los investigadores identificar los segmentos y comparar el ADN de diferentes organismos.
¿para qué se utilizan las electroforesis en Gel?,
El propósito de la electroforesis en gel es visualizar, identificar y distinguir moléculas que han sido procesadas por un método previo como PCR, digestión enzimática o una condición experimental. A menudo, las mezclas de ácidos nucleicos o proteínas que se recogen de un experimento/método anterior se ejecutan a través de electroforesis en gel para determinar la identidad o diferenciar entre moléculas.,
pasos de electroforesis en Gel
los pasos amplios involucrados en un protocolo común de electroforesis en gel de ADN:
preparación de las muestras para correr
El ADN se aísla y se preprocesa (por ejemplo, PCR, digestión enzimática) y se compone en solución con tinte para ayudar a visualizar el movimiento de la muestra a través del gel.
se prepara una solución de gel de agarosa TAE
El tampón TAE proporciona una fuente de iones para configurar el campo eléctrico durante la electroforesis., La concentración peso-volumen de agarosa en el tampón TAE se utiliza para preparar la solución. Por ejemplo, si se requiere un gel de agarosa al 1%, se agrega 1 g de agarosa a 100 ml de TAE. El porcentaje de agarosa utilizado se determina por qué tan grande o pequeño se espera que sea el ADN. Si uno está buscando separar un grupo de bandas de ADN de menor tamaño (<500bp), se prepara un gel de agarosa de mayor porcentaje (>1%). El mayor porcentaje de agarosa crea un tamiz más denso para aumentar la separación de pequeñas diferencias de longitud de ADN., La solución de agarosa-TAE se calienta para disolver la agarosa.
colada del gel
la solución de agarosa TAE se vierte en una bandeja de colada que, una vez que la solución de gel se ha enfriado y solidificado, crea una losa de gel con una fila de pozos en la parte superior.
Configuración de la cámara de electroforesis
El gel sólido se coloca en una cámara llena de tampón TAE. El gel se coloca de manera que los pozos de la cámara estén más cerca del electrodo negativo de la cámara.,
cargando el gel
Los Pozos de la cámara de gel se cargan con las muestras de ADN y, por lo general, también se carga una escalera de ADN como referencia para los tamaños.
electroforesis
Los cables negativos y positivos están conectados a la cámara y a una fuente de alimentación donde se ajusta la tensión. Al encender la fuente de alimentación se configura el campo eléctrico y las muestras de ADN cargadas negativamente comenzarán a migrar a través del gel y se alejarán del electrodo negativo hacia el positivo.,
detener la electroforesis y visualizar el ADN
Una vez que el tinte azul en las muestras de ADN ha migrado a través del gel lo suficientemente lejos, la fuente de alimentación se apaga y el gel se retira y se coloca en una solución de bromuro de etidio. El bromuro de etidio intercala entre el ADN y es visible en la luz UV. A veces, el bromuro de etidio se agrega directamente a la solución de gel de agarosa en el paso 2. El gel teñido con bromuro de etidio se expone a la luz UV y se toma una foto. Las bandas de ADN se visualizan desde cada carril correspondiente a un pozo de cámara., La escalera de ADN que se cargó también se visualiza y la longitud de las bandas de ADN se puede estimar. Se da un ejemplo en la figura siguiente.
Tipos de Electroforesis en Gel
Hay dos tipos de gel de electroforesis nativa y la desnaturalización. La electroforesis en gel nativo generalmente intenta mantener el ARN o la proteína en su estructura nativa mientras se ejecuta a través del gel., La electroforesis en gel desnaturalizante intenta reducir el ARN o la proteína en su estructura más lineal antes o durante la electroforesis en gel.
la desnaturalización del ARN o proteína se logra mediante la adición de un agente reductor a la muestra, gel y/o tampón. El agente reductor separa los enlaces dentro de la molécula de ARN o proteína y, por lo tanto, reduce su estructura secundaria. La estructura secundaria de una proteína o ARN influirá, de manera no lineal, en la velocidad con la que migra a través de un gel., Una forma lineal desnaturalizada de ARN o proteína, sin embargo, migrará proporcionalmente a su tamaño lineal (pares de bases o kilo Daltons). La electroforesis en gel desnaturalizante es a menudo más precisa para la identificación del tamaño, mientras que la electroforesis en gel nativo se usa generalmente para identificar complejos proteicos más grandes.
ejemplos de electroforesis en Gel
- la electroforesis en Gel de agarosa TAE se usa más comúnmente para el ADN.
- TBE y Página de desnaturalización (electroforesis en gel de poliacrilamida) son comunes para la separación de ARN.,
- SDS PAGE es una electroforesis en gel desnaturalizante comúnmente utilizada para la identificación y separación de proteínas.