verificación Experimental de modelos
el primer enfoque (3) identificó los sitios de iniciación primarios en 14 proteínas, incluyendo la RNasa pancreática bovina a y la mioglobina de cachalote, y también otros sitios de iniciación menos estables (11) en la RNasa A. El sitio de iniciación primario para la RNasa A se identificó en este modelo como residuos 106-118. La aplicación del segundo enfoque (8) a la RNasa A (13) condujo a seis sitios (ilustrado en la Fig., 3 a), que eran coherentes con las identificadas (11) por el primer enfoque (3). Se trata de residuos 4-11 (región A), residuos 25-34 (región B), residuos 51-57 (región C) y estructuras antiparalelas (no necesariamente plisadas) formadas por la Asociación de residuos 53-67 con residuos 69-79 (región D), residuos 71-90 con residuos 91-111 (región E), y residuos 103-111 con residuos 115-124 (región F). Los pasos posteriores a lo largo de la vía de plegamiento consisten en el crecimiento o la coalescencia de estas regiones. La región G se forma cuando los residuos se doblan 36-48 contra la hélice B., La región G, Sin embargo, contiene contactos de mayor alcance que la hélice B. Por lo tanto, se considera que G se forma en una etapa posterior a la B. La Región L está formada por la Asociación de la región a con B, G y C. Esta secuencia estructural es seguida por la región H, formada cuando las regiones C y D entran en contacto; por la región K que contiene contactos entre las regiones e Y F; Por la región J en la que las regiones C y D forman contactos con las regiones e Y F; y por la región I que contiene contactos de las regiones e Y H con G. finalmente, la región M Se forma cuando la región a entra en contacto con E y F.,
el predecido sitio de iniciación de plegamiento primario de la RNasa a está de acuerdo con el giro observado en los residuos 113 y 114 en la molécula nativa, con el muy alto grado de conservación de residuos no polares en el sitio 106-118 de 23 especies de mamíferos de esta proteína (3), y con información experimental sobre intermedios detectados en el despliegue térmico de la RNasa a (14)., Pruebas de RMN de estructura local en RNasa a desplegada en condiciones de plegamiento (15) y en fragmentos de la misma (16), y estudios inmunoquímicos sobre la formación de sitios antigénicos estables (en la superficie de la proteína, cubriendo el sitio de iniciación hidrofóbico primario enterrado cuando se oxida la RNasa a reducida (ref. 17 y figura 8 de ref. 18), también fueron consistentes con este cuadro. Otras pruebas experimentales que apoyan la existencia de sitios de iniciación A-F Se proporcionan en ref. 11.,
para la apomioglobina, el primer enfoque (3) identificó el sitio de iniciación de plegamiento primario como residuos 103-115, que abarca la mayor parte de la hélice G, con la secuencia Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-Ser-Glu-Ala-Ile-Ile-His-Val-Leu., La aplicación del segundo enfoque (8), y los cálculos de energía conformacional, llevaron a la sugerencia de que las interacciones entre las hélices A, G Y H de la apomioglobina podrían ser importantes para la iniciación del plegamiento (19), consistente con los resultados experimentales que implicaron a estas regiones en los intermedios de equilibrio de la apomioglobina (20) y en los primeros pasos cinéticos en la vía del plegamiento (21). Estudios experimentales recientes de mutantes de mioglobina (22, 23) proporcionan un apoyo convincente para modelos que incorporan iniciación hidrofóbica y propagación de plegamiento.,
La Apomioglobina se ha convertido en un paradigma para la investigación de las vías de plegamiento (24). Parte de la molécula de apomioglobina, que consiste en las hélices A, G y H y parte de la hélice B, se pliega rápidamente para formar un intermedio en la Vía, con el resto de la cadena polipeptídica plegándose a una velocidad más lenta, del orden de los segundos (21, 25). Los fragmentos peptídicos de apomioglobina correspondientes a las hélices G Y H mostraron una propensión a la estructura helicoidal (26-28), mientras que los péptidos correspondientes al resto de la proteína mostraron una propensión mucho menor a la formación de hélices (29)., Sin embargo, un experimento en el que la hélice H de la mioglobina fue mutada para disminuir su propensión helicoidal (30) mostró muy poca influencia en la tasa de plegamiento de la proteína. Se observó un efecto mucho mayor cuando la histidina distal (H64) se cambió a fenilalanina: la sustitución de una cadena lateral no polar por la histidina polar enterrada resultó en un aumento significativo en la tasa de plegamiento (31). Estos estudios apuntaron hacia la importancia del empaquetamiento de la cadena lateral, particularmente en las superficies de contacto de las hélices, para la tasa de plegamiento de la apomioglobina.,
La Apomioglobina tiene la ventaja de que puede ser estudiada en equilibrio bajo una serie de condiciones de solución que se aproximan a algunas de las etapas observables en la vía de plegamiento cinético. Por lo tanto, ha sido posible definir las propensiones conformacionales de la apomioglobina desplegada y parcialmente plegada por RMN (32-35). Curiosamente, la apomioglobina desplegada con ácido muestra una propensión a la estructura helicoidal no nativa en una región que conecta las hélices D y E, así como la estructura similar a la nativa observada en las hélices A y H, que se había predicho en los estudios cinéticos (34)., Los estudios de RMN de las propensiones conformacionales de las diversas formas de apomioglobina (32-35) incluyeron la determinación de los parámetros de relajación de la cadena polipeptídica para el sitio, específicamente determinar la dinámica de la columna vertebral en cada uno de los estados de la proteína. En lugar del análisis» libre de modelos » que es adecuado para proteínas plegadas, los datos de relajación se analizaron calculando las funciones de densidad espectral reducida J(0), J(wN) y J(wH) (36). La función J (0) informa sobre los movimientos de escala de tiempo µs–ms y sugirió que, para la apomioglobina a pH 2.,3, las hélices A y G estaban haciendo contactos transitorios (34). Este emocionante resultado, más tarde validado por estudios de RMN de spin-label (37), proporcionó evidencia definitiva de contactos de largo alcance similares a los nativos en una proteína desplegada. Aún más intrigante, la función J (wN), que informa sobre el movimiento de escala de tiempo ps–ns, mostró una variación dependiente de la secuencia, que podría correlacionarse con la variación en un parámetro calculado, el «área promedio enterrada al plegarse» (aabuf) (10)., Este parámetro, que incorpora tanto el tamaño del residuo como la hidrofobicidad, se define para aminoácidos individuales, pero generalmente se promedia sobre una ventana de cinco a nueve residuos en la secuencia y proporciona una estimación cuantitativa alternativa de la hidrofobicidad definida por Matheson y Scheraga (3) en términos de energía libre de formación. En el caso de la apomioglobina a pH 2.3, picos en la gráfica de J (wN) vs., el número de residuos, que indica la restricción del movimiento a escala de tiempo sub-ns, correspondió extremadamente bien con los picos en la gráfica de AABUF, que indican un número superior al promedio de aminoácidos grandes y/o no polares. Esta observación sugiere que hay un patrón en la secuencia de aminoácidos, definido por agrupaciones de cadenas laterales grandes y/o no polares, como en el modelo de ref. 3, que conduce a la restricción del movimiento de la espina dorsal del polipéptido causada por la formación hidrofóbica local del racimo.
Apomioglobina a pH 2.,3 retiene una pequeña propensión a la estructura helicoidal en las hélices A Y H, A juzgar por los cambios químicos observados en la RMN (34). Estas propensiones son abolidas en presencia de 8 M de urea (35), sin embargo, la dependencia secuencial de las tasas de relajación de la apomioglobina desnaturalizada por urea también muestra una correlación intrigante con el parámetro AABUF. En este caso, la correlación es entre mínimos en J (wH) y máximos de AABUF, lo que sugiere que las interacciones hidrofóbicas locales que restringen el movimiento de la columna vertebral en escalas de tiempo sub-ns son persistentes incluso en 8 M de urea.,
para probar la hipótesis de que el parámetro aabuf, es decir, la hidrofobicidad, podría ser utilizado para predecir los sitios de inicio de plegamiento en la cadena polipeptídica, se realizó un conjunto específico de mutaciones de apomioglobina (23). La hélice A, que participa en el intermedio cinético que se forma por primera vez al plegar la apomioglobina WT, tiene una secuencia que da lugar a un máximo en el parámetro AABUF, mientras que la hélice E, que es de hecho altamente hidrofóbica de acuerdo con las escalas de hidrofobicidad convencionales, tiene un aabuf bastante bajo a lo largo de su longitud., En la apomioglobina plegada, la cadena lateral de Trp-14, en la hélice A, se encuentra frente a la columna vertebral de la hélice e en Gly-73. Se preparó una mioglobina de doble mutante, en la que Trp-14 fue reemplazado por Gly, y Gly-73 fue reemplazado por Trp. Se razonó que la estructura plegada de la proteína debería ser mínimamente perturbada por este intercambio, pero que el parámetro AABUF para las hélices A y E debería verse drásticamente afectado. La pregunta era si la vía de plegado también se vería afectada. De hecho, el plegamiento del mutante en el que se intercambian G73 y W14 ocurre por una vía diferente a la de la proteína WT., Todas las variantes de apomioglobina que hasta ahora han sido estudiadas se pliegan a través de una fase de explosión intermedia que contiene estructura helicoidal. En el caso de la apomioglobina WT, este intermedio contiene las hélices A, G y H (y también parte de la hélice B). En el mutante de intercambio G73–W14, el intermedio contiene las hélices E, G y H; la hélice A no está protegida en la fase inicial de plegado, sino que se pliega más tarde. Este resultado (ilustrado en la Fig. 4) fue confirmado por estudios de etiquetas espín que muestran contactos entre las hélices E, G y H en el mutante, en lugar de los contactos a, G y H observados en la proteína WT.,