A Cas9 with Pam recognition for adenine dinucleotides

Discovery of SmacCas9

to modify the ancestral 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) Pam specificity of SpyCas9, early and recent reports have employed directed evolution (E.G., «VQR», «EQR», «VRER», and variantes «Nrnh») o diseño racional informado por la estructura cristalina (por ejemplo, variantes «Qqr», «ng» y «nr») 17,18,19,20,21,22. Estos informes se centraron en los residuos de arginina en contacto con PAM R1333 y R1335 que suprimen la función cuando están mutados exclusivamente., Si bien esos estudios identificaron mutaciones compensatorias que resultaron en una especificidad PAM alterada, las variantes Cas9 que produjeron mantuvieron una preferencia por la guanina en al menos una posición de la secuencia PAM para la edición in vivo reportada. Los informes concurrentes han utilizado información evolutiva para relajar aún más la especificidad Pam canónica 5\(^{\prime}\)-NNGRRT-3\(^{\prime}\) de Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) o para descubrir la especificidad Pam alternativa 5\(^{\prime}\)-NNNNCC-3\(^{\prime}\) a la especificidad Pam canónica 5\(^{\prime}\)-NNNNGHTT-3\(^{\prime}\) de Neisseria meningitidis cas923,24., Las nucleasas de estos dos nuevos informes, sin embargo, todavía prefieren el contenido de GC en al menos una posición de la secuencia PAM. Nuestro objetivo era elevar tales requisitos previos de contenido de GC a través de un flujo de trabajo personalizado impulsado por la bioinformática que explota la diversidad Pam existente en el Streptococcus genus25. Usando esta estrategia, nos centramos en SmacCas9 como que tiene el potencial de tener una especificidad PAM no GC alterada al alinear 115 ortólogos de SpyCas9 de UniProt (limitado a aquellos con una puntuación de blossom62 superior al 70%)., A partir de la alineación encontramos que SmacCas9 era uno de los dos homólogos cercanos, junto con un Streptococcus mutans B112sm-a Cas9 (SmutCas9), que poseía glutaminas en ambas posiciones alineadas con las argininas de contacto Pam altamente conservadas (Fig. 1a-b; suplemento Fig. 2A). Se sabe que los residuos de arginina prefieren fuertemente las guaninas en el paisaje de interacción aminoácido-base, como lo demuestra la especificidad 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) de SpyCas9. Los residuos de glutamina, por otro lado, se unen preferentemente a las adeninas, a través de la interacción con el borde del surco mayor26., Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que SmacCas9 había coevolucionado naturalmente las mutaciones compensatorias necesarias para obtener un nuevo reconocimiento de Pam rico en adenina. Un pequeño tamaño de muestra de 13 espaciadores de la matriz CRISPR de su genoma correspondiente nos impidió inferir con confianza el SmacCas9 Pam in silico., Sin embargo, la posibilidad de que SmacCas9 requiera menos contenido de GC en su PAM fue apoyada por similitudes de secuencia con la variante «QQR» que tiene 5\(^{\prime}\)-NAAG-3\(^{\prime}\) specificy27, además del supuesto consenso de AT-rich PAM para espaciadores de origen de fagos en arrays CRISPR asociados con SmutCas9 altamente homólogos9, que fueron identificados con la ayuda de nuestra canalización SPAMALOT descrita anteriormente y consistentes con predicciones anteriores (Fig. 1C; suplemento Fig. 2b; suplemento Fig. 3) 25,28.

una alineación de secuencia de SpyCas9, su variante QQR y SmacCas9. El paso en la línea roja subrayada marca la Unión de SpyCas9 y SmacCas9 para construir un híbrido SpyMac. El logotipo de la secuencia (herramienta en línea Weblogo) inmediatamente debajo de la alineación representa la conservación en 11 posiciones alrededor de las argininas en contacto con PAM de SpyCas9., b la organización del dominio de SpyCas9 yuxtapuesta sobre una estructura codificada por colores de SpyCas9 guiado por ARN y unido al objetivo (PDB ID 5F9R). Las dos hebras de ADN son negras con la excepción de un segmento magenta correspondiente al PAM. Se utiliza un mapa de color azul–verde–rojo para etiquetar el Dominio PI Cas9 y guiar la secuencia espaciadora para resaltar las estructuras que confieren especificidad de secuencia y la prevalencia de contactos intra-dominio dentro de la PI43. C Un logotipo de secuencia generado en línea (WebLogo) que se introdujo con secuencias Pam putativas encontradas en el fago de Streptococcus y asociadas con homólogos SmacCas9 cercanos.,

ingeniería y caracterización PAM de SpyMac

se procedió a determinar empíricamente las preferencias PAM de varios ortólogos de estreptococos que cambian uno o ambos de los contactos Pam críticos. Con base en ejemplos demostrados del dominio de interacción PAM (PID) y del ARN guía (gRNA) que tienen compatibilidad cruzada entre ortólogos Cas9 que están estrechamente relacionados y activos, construimos nuevas variantes mediante el intercambio racional de la región PI de SpyCas9 (dSpyCas9) catalíticamente «muertos» con los de los ortólogos seleccionados (suplemento Fig., 2A–B) 29,30. Las variantes ensambladas, incluyendo dSpyMacCas9 (aquí referido como dSpyMac), se cotransformaron por separado en células de E. coli, junto con el ARN guía derivado de S. pyogenes y una biblioteca PAM de 8 mer de representación base uniforme en el circuito genético PAM-SCANR, establecido por Leenay et al.31. El circuito regula un reportero de proteína fluorescente verde (GFP) en proporción a la fuerza de unión a PAM. Por lo tanto, recolectamos las poblaciones celulares GFP positivas por citometría de flujo (suplemento Fig., 4) y Sanger los secuenció alrededor del sitio de la PAM para determinar las preferencias de la base en función de la posición en el reconocimiento PAM de una variante correspondiente. dSpyMac, más que dSpyMutCas9, generó un perfil de trazas que fue más consistente con el reconocimiento de Pam independiente de la guanina, junto con una especificidad dominante para dinucleótidos de adenina (Fig. 2a; suplemento Fig. 2C).

cromatogramas que representan el enriquecimiento basado en PAM-SCANR de secuencias PAM de reconocimiento de variantes de una biblioteca 5\(^{\prime}\)-NNNNNNNN-3\(^{\prime}\). B geles de agarosa teñidos con SYBR que muestran digestión in vitro de sustratos de 10 nM 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) en 16 minutos de incubación con 100 nM de conjuntos enzimáticos de ribonucleoproteína purificados. Las flechas distinguen las bandas de los productos hendidos de los sustratos no hendidos (banda superior)., Las gráficas matriciales resumen los cálculos de fracciones escindidas, que se llevaron a cabo en un script personalizado para procesar imágenes de gel. Las muestras se realizaron en duplicados biológicos independientes (n = 2). C mediciones del curso temporal de la escisión del sustrato de ADN objetivo para SmacCas9 y SpyMac. D escisión del sustrato de ADN trazada en función de proporciones molares de 0,25:1, 1:1 y 4:1 de ribonucleoproteína para el objetivo de SpyCas9 de tipo salvaje y spymac híbrido. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.,

a continuación, purificamos las enzimas activas de nucleasa para continuar sondeando el potencial de reconocimiento del objetivo de ADN y la singularidad de SpyMac. (Suplemento Fig. 5A) 27,32. Incubamos individualmente las enzimas del complejo ribonucleoproteico (compuestas de Cas9 + crRNA + tracrRNA) con sustratos Diana de doble cadena de los 5\(^{\prime}\)/3\(^{\prime}\)-combinaciones de bases vecinas en un dinucleótido de adenina PAM (5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\); Fig. 2b)., Una breve digestión de 16 minutos indicó tanto smaccas9 de tipo salvaje como el híbrido SpyMac escindido adyacente a los motivos 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) de manera más amplia y uniforme que la variante qqr reportada anteriormente. SpyMac se distinguió aún más con velocidades rápidas de corte de ADN que se asemejan a la cinética de digestión rápida de SpyCas9 (Fig. 2c-d) 33. Se corrieron reacciones que utilizaron longitudes de espaciador de arnrr variables y secuencia de arnrtrac, ya que esta última difiere ligeramente entre los genomas de S. macacae y S. pyogenes (suplemento Fig. 5B–E)., Ninguno de estos dos parámetros compensó la tasa de escisión más lenta de SmacCas9, pero notamos una mejora marginal en la actividad de la forma de tipo salvaje con su tracrRNA nativo, que se comporta con la interfaz de la interacción guía-Cas9 siendo en su mayoría fuera del Dominio PI.

edición del genoma con iSpyMac

Un análisis Indel CRISPResso2 siguiendo NGS de regiones genómicas amplificadas para evaluar la edición en destino de Ispymac en comparación con SpyMac y SpyCas9, en los 5\(^{\prime}\)-NAA-3\(^{\prime}\) y 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) secuencias Pam. Las muestras se realizaron en dos réplicas de transfección independientes (n = 2). B Efficiency heatmap of mismatch tolerance assay on genomic targets., Las frecuencias Indel cuantificadas, evaluadas por el algoritmo TIDE 41, Se exhiben para cada desajuste simple o doble etiquetado en la secuencia sgRNA para la variante Cas9 indicada y la secuencia Pam indicada. Las muestras se realizaron en dos réplicas de transfección independientes (n = 2). C CRISPResso2 análisis de edición de bases genómicas siguiendo NGS de amplicones genómicos para evaluar la conversión de citosinas a timinas por iSpyMac-BE3. Las muestras se realizaron en dos réplicas de transfección independientes (n = 2). Todos los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.,

a continuación, evaluamos la tolerancia de iSpyMac a secuencias no coincidentes, empleando sgRNAs que albergan desajustes dobles o simples a un protospacer fijo dentro del gen AAVS, que posee una secuencia pam 5\(^{\prime}\)-GAAG-3\(^{\prime}\). iSpyMac demostró capacidades de edición en objetivos con desajustes individuales dentro del segmento Pam-proximal del sgRNA., Para mitigar esta supuesta propensión fuera del objetivo, introdujimos la mutación R691A, que previamente se aisló a través de la selección bacteriana para SpyCas9 para mantener una alta actividad en el objetivo al tiempo que se reducía la edición fuera del objetivo35. Nuestra variante de alta fidelidad, HiFi-iSpyMac, mostró una actividad casi insignificante en secuencias no coincidentes, en comparación con la enzima original, con una pérdida mínima de actividad en el objetivo (Fig. 3b).,

Por último, seleccionamos una ventana de cuatro nucleótidos en el locus VEGFA en un contexto de secuencia tal que cualquier otra endonucleasa CRISPR con uso reportado para la edición de bases no permitiría su edición de bases con una enzima fusionada con citidina desaminasa 36. En consecuencia, cotransfectamos células HEK293T con una forma nickasa de iSpyMac derivada de la arquitectura BE3 previamente reportada para la edición de bases de citosina (ISPYMAC-BE3) y el plásmido sgRNA dirigido a una Pam aguas abajo de los nucleótidos seleccionados5., Se midieron los niveles efectivos de edición de base en células cosechadas, que exhibieron más del 20% de conversión de citosina a timina en estas posiciones a través del análisis NGS (Fig. 3c).