Dieses Material wird begleitet von einer Präsentation zur Proteinstruktur und den Prinzipien der Denaturierung von Proben und der diskontinuierlichen Gelelektrophorese.
Die Trennung von Makromolekülen in einem elektrischen Feld wird Elektrophorese genannt. Eine sehr verbreitete Methode zur Trennung von Proteinen durch Elektrophorese verwendet ein diskontinuierliches Polyacrylamidgel als Trägermedium und Natriumdodecylsulfat (SDS), um die Proteine zu denaturieren. Die Methode wird als Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bezeichnet., Das am häufigsten verwendete System wird auch als Laemmli-Methode nach dem britischen Laemmli bezeichnet, der als erster ein Papier mit SDS-PAGE in einer wissenschaftlichen Studie veröffentlichte.
SDS (auch Laurylsulfat genannt) ist ein anionisches Waschmittel, was bedeutet, dass seine Moleküle, wenn sie aufgelöst werden, eine negative Nettoladung innerhalb eines weiten pH-Bereichs haben. Eine Polypeptidkette bindet Mengen an SDS im Verhältnis zu ihrer relativen Molekülmasse. Die negativen Ladungen auf SDS zerstören den größten Teil der komplexen Struktur von Proteinen und werden in einem elektrischen Feld stark von einer Anode (positiv geladene Elektrode) angezogen.,
Polyacrylamidgele verhindern, dass größere Moleküle so schnell wandern wie kleinere Moleküle. Da das Ladungs-zu-Massen-Verhältnis bei SDS-denaturierten Polypeptiden nahezu gleich ist, hängt die endgültige Trennung von Proteinen fast vollständig von den Unterschieden in der relativen Molekularmasse von Polypeptiden ab. In einem Gel gleichmäßiger Dichte ist der relative Migrationsabstand eines Proteins (Rf, das f als Index) negativ proportional zum Protokoll seiner Masse., Wenn Proteine bekannter Masse gleichzeitig mit den Unbekannten ausgeführt werden, kann die Beziehung zwischen Rf und Masse aufgetragen und die Massen unbekannter Proteine geschätzt werden.
Die Proteintrennung durch SDS-PAGE kann verwendet werden, um die relative Molekularmasse zu schätzen, die relative Häufigkeit von Hauptproteinen in einer Probe zu bestimmen und die Verteilung von Proteinen zwischen Fraktionen zu bestimmen. Die Reinheit von Proteinproben kann beurteilt und der Fortschritt eines Fraktionierungs-oder Reinigungsverfahrens verfolgt werden., Verschiedene Färbemethoden können verwendet werden, um seltene Proteine nachzuweisen und etwas über ihre biochemischen Eigenschaften zu erfahren. Spezialisierte Techniken wie Western Blotting, zweidimensionale Elektrophorese und Peptid-Mapping können verwendet werden, um extrem seltene Genprodukte zu erkennen, Ähnlichkeiten zwischen ihnen zu finden und Isoenzyme von Proteinen zu erkennen und zu trennen.
Molekularmasse versus Molekulargewicht
Die Molekularmasse (Symbol m) wird in Daltonen (Da) ausgedrückt. Ein Dalton ist definiert als 1/12 die Masse von Kohlenstoff 12., Die meisten Makromoleküle sind groß genug, um das kiloDalton (kDa) zur Beschreibung der molekularen Masse zu verwenden. Molekulargewicht ist nicht das gleiche wie Molekularmasse. Es wird auch als relative Molekularmasse bezeichnet (Symbol Mr, wobei r ein Index ist). Das Molekulargewicht ist definiert als das Verhältnis der Masse eines Makromoleküls zu 1/12 der Masse eines Kohlenstoff-12-Atoms. Es ist eine dimensionslose Größe.
Wenn die Literatur eine Masse in Da oder kDa gibt, bezieht sie sich auf molekulare Masse. Es ist falsch, das Molekulargewicht (relative Molekularmasse) in Daltonen auszudrücken., Dennoch finden Sie den Begriff Molekulargewicht, der mit Daltonen oder Kilodaltonen in einigen Literatur verwendet wird, oft unter Verwendung der Abkürzung MW für Molekulargewicht.
Polyacrylamidgele für SDS-PAGE
Viele Systeme für die Proteinelektrophorese wurden entwickelt, und die für SDS-PAGE verwendeten Geräte sind sehr unterschiedlich. Die auf diesen Seiten verwendete Methodik verwendet die Laemmli-Methode. Die Bezugnahme auf das Laemmli-Verfahren in einem Abschnitt Materialien und Methoden macht es überflüssig, die Puffer, das Gießen von Gelen, Geräten usw. zu beschreiben., Sofern das Papier keine Modifikation des Verfahrens verwendet, sind die einzigen Details von SDS-PAGE, die in einem Methodenabschnitt gemeldet werden sollten, prozentuales Acrylamid (%T) in einem Gel, relativer Prozentsatz und Art des Vernetzers (%C) und vielleicht ein Verweis auf die Gelabmessungen. Wir verwenden eine „mini-gel“ – system, mit 3 1/4″ x 4″ gel-Kassetten.
SDS-PAGE kann auf vorgegossenen Gelen durchgeführt werden, was die Mühe und Gefahr der Arbeit mit Acrylamid erspart. Die folgende Beschreibung gilt für werkseitig hergestellte Gieß – und Laufgeräte, die viel billiger sind als handelsübliche Geräte., Ein Vorteil der erstmaligen Herstellung eigener Gele ist neben der Wirtschaftlichkeit ein tieferes Verständnis des Prozesses.
Unabhängig vom System erfordert die Zubereitung das Gießen von zwei verschiedenen Acrylamidschichten zwischen Glasplatten. Die untere Schicht (trennendes oder auflösendes Gel) ist dafür verantwortlich, Polypeptide tatsächlich nach Größe zu trennen. Die obere Schicht (Stapelgel) umfasst die Probenbohrungen. Es wurde entwickelt, um Proteine in einer Probe zwischen zwei sich bewegenden Grenzen aufzufegen, so dass sie beim Erreichen des Trenngels in mikrometerdünne Schichten komprimiert (gestapelt) werden.,