Ein Cas9 mit PAM-Erkennung für Adenindinukleotide

Entdeckung von SmacCas9

Zur Modifikation der Ahnen 5\(^{\prime}\) – NGG-3\(^{\prime}\) PAM-Spezifität von SpyCas9, frühe und jüngste Berichte haben eine gerichtete Evolution eingesetzt (z. B. „VQR“, „EQR“, „VR“ und „NRNH“ Varianten) oder rationales Design, das durch Kristallstruktur (z. B. Varianten „QQR“, „NG“ und „NR“) 17,18,19,20,21,22. Diese Berichte konzentrierten sich auf die PAM-kontaktierenden Argininrückstände R1333 und R1335, die die Funktion abschaffen, wenn sie ausschließlich mutiert sind., Während diese Studien kompensatorische Mutationen identifizierten, die zu einer veränderten PAM-Spezifität führten, behielten die Cas9-Varianten, die sie produzierten, eine Guaninpräferenz in mindestens einer Position der PAM-Sequenz für die berichtete In-vivo-Bearbeitung bei. Gleichzeitige Berichte verwendet haben, evolutionäre Informationen zur weiteren Entspannung der kanonische 5\(^{\prime}\)-NNGRRT-3\(^{\prime}\) PAM Spezifität von Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) oder zu entdecken, alternative 5\(^{\prime}\)-NNNNCC-3\(^{\prime}\) PAM Spezifität der kanonische 5\(^{\prime}\)-NNNNGHTT-3\(^{\prime}\) PAM von Neisseria meningitidis Cas923,24., Die Nukleasen aus diesen beiden neuen Berichten bevorzugen jedoch immer noch den GC-Gehalt in mindestens einer Position der PAM-Sequenz. Ziel war es, solche GC-Content-Voraussetzungen über einen benutzerdefinierten Bioinformatik-gesteuerten Workflow zu schaffen, der die vorhandene PAM-Vielfalt im Streptococcus genus25 abbaut. Mit dieser Strategie haben wir uns auf SmacCas9 eingelassen, da es das Potenzial hat, eine veränderte Nicht-GC-PAM-Spezifität beim Ausrichten von 115 Orthologen von SpyCas9 von UniProt zu tragen (begrenzt auf solche mit einem paarweisen BLOSSOM62-Score von mehr als 70%)., Aus der Ausrichtung fanden wir, dass SmacCas9 einer von zwei engen Homologen war, zusammen mit einem Streptococcus mutans B112SM-A Cas9 (SmutCas9), der Glutamine an beiden Positionen besaß, die auf die ansonsten hochkonservierten PAM-kontaktierenden Arginine ausgerichtet waren (Abb. 1a–b; Ergänzende Abb. 2A). Es ist bekannt, dass Argininreste Guanine in der Aminosäure-Base-Wechselwirkungslandschaft stark bevorzugen, was durch die 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) – Spezifität von SpyCas9 belegt wird. Glutaminreste hingegen binden bevorzugt an Adenine durch Wechselwirkung mit der Hauptnutenkante26., Wir stellten daher die Hypothese auf, dass SmacCas9 auf natürliche Weise die notwendigen kompensatorischen Mutationen koevolviert hatte, um eine neue adeninreiche PAM-Erkennung zu erhalten. Eine kleine Stichprobengröße von 13 Abstandshaltern aus dem CRISPR-Array des entsprechenden Genoms verhinderte, dass wir die SmacCas9-PAM in Silico sicher ableiten konnten., Nichtsdestotrotz wurde die Möglichkeit für SmacCas9, weniger GC-Gehalt in seiner PAM zu benötigen, durch Sequenzähnlichkeiten mit der „QQR“-Variante mit 5\(^{\prime}\)-NAAG-3\(^{\prime}\) Spezifität unterstützt27, zusätzlich zu dem AT-reichen mutmaßlichen Konsens PAM für Phage-Ursprungs-Spacer in CRISPR-Arrays, die mit hoch homologen SmutCas9 assoziiert sind, die mit Hilfe unserer zuvor beschriebenen SPAMALOT-Pipeline identifiziert wurden und mit früheren Vorhersagen übereinstimmen (Abb. 1c; Ergänzende Abb. 2B; Ergänzende Abb. 3) 25,28.

Engineering und PAM-Charakterisierung von SpyMac

Wir haben die PAM-Präferenzen mehrerer Streptococcus-Orthologen, die einen oder beide der kritischen PAM-Kontakte ändern, empirisch bestimmt. Basierend auf nachgewiesenen Beispielen der PAM-Interaction Domain (PID) und der Guide RNA (gRNA) mit Kreuzkompatibilität zwischen eng verwandten und aktiven Cas9-Orthologen konstruierten wir neue Varianten, indem wir die PI-Region von katalytisch „totem“ SpyCas9 (dSpyCas9) rational mit denen der ausgewählten Orthologen austauschten (Ergänzende Abb., 2A–B)29,30. Zusammengesetzte Varianten, einschließlich dSpyMacCas9 (hierin als dSpyMac bezeichnet), wurden getrennt in E. coli-Zellen cotransformiert, zusammen mit einer von S. pyogenes abgeleiteten leitenden RNA und einer 8-mer-PAM-Bibliothek einheitlicher Basendarstellung im genetischen PAM-SCANR-Kreislauf, die von Leenay et al.31. Die Schaltung regelt einen grün fluoreszierenden Proteinreporter (GFP) im Verhältnis zur PAM-Bindungsstärke. Daher sammelten wir die GFP-positiven Zellpopulationen durch Durchflusszytometrie (Ergänzende Abb., 4) und Sanger sequenzierte sie um die Stelle der PAM, um positionsweise Basispräferenzen in der PAM-Erkennung einer entsprechenden Variante zu bestimmen. dSpyMac, mehr als dSpyMutCas9, erzeugte ein Spurenprofil, das am konsistentesten mit der Guanin-unabhängigen PAM-Erkennung übereinstimmte, zusammen mit einer dominanten Spezifität für Adenindinukleotide (Abb. 2a; Ergänzende Abb. 2C).

a Chromatogramme, die die PAM-SCANR-basierte Anreicherung variantenerkennender PAM-Sequenzen aus einer 5\(^{\prime}\)-NNNNNNNN-3\(^{\prime}\) Bibliothek darstellen. b SYBR-gefärbte Agarosegele, die in vitro eine Verdauung von 10 nM 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) Substraten nach 16 Minuten Inkubation mit 100 nM gereinigten Ribonukleoproteinenzymanordnungen zeigen. Pfeile unterscheiden das Banding der gespaltenen Produkte vom nicht gespaltenen Substrat (oberes Band)., Matrixdiagramme fassen Spaltfraktionsberechnungen zusammen, die in einem benutzerdefinierten Skript zur Verarbeitung von Gelbildern durchgeführt wurden. Die Proben wurden in unabhängigen biologischen Duplikaten (n = 2) durchgeführt. c Zeitverlaufsmessungen der Ziel-DNA-Substratspaltung für SmacCas9 und SpyMac. d DNA-Substratspaltung als Funktion von 0,25:1, 1:1 und 4:1 molaren Verhältnissen von Ribonukleoprotein zum Ziel für Wildtyp-SpyCas9 und Hybrid-SpyMac aufgetragen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.,

Als nächstes haben wir Nuklease-aktive Enzyme gereinigt, um das DNA-Zielerkennungspotential und die Einzigartigkeit von SpyMac weiter zu untersuchen. (Ergänzende Abb. 5A)27,32. Wir haben die Ribonukleoproteinkomplexenzyme (bestehend aus Cas9 + crRNA + tracrRNA) einzeln mit doppelsträngigen Zielsubstraten aller 5\(^{\) inkubiert}\)/3\(^{\primzahl}\)-benachbarte Basiskombinationen an einem Adenindinukleotid PAM (5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\); Abb. 2b)., Eine kurze 16-minütige Verdauung zeigte sowohl den Wildtyp SmacCas9 als auch den hybriden SpyMac an, der neben 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) – Motiven breiter und gleichmäßiger als die zuvor gemeldete QQR-Variante gespalten war. SpyMac zeichnete sich weiter durch schnelle DNA-Schnittraten aus, die der schnell verdaulichen Kinetik von SpyCas9 ähneln (Abb. 2c–d)33. Wir führten Reaktionen durch, bei denen unterschiedliche crRNA-Distanzlängen und tracrRNA-Sequenzen verwendet wurden, da letztere zwischen den S. macacae-und S. pyogenes-Genomen geringfügig unterschiedlich sind (Ergänzende Abb. 5B–E)., Keiner dieser beiden Parameter kompensierte die langsamere Spaltrate von SmacCas9, aber wir bemerkten eine marginale Verbesserung der Aktivität der Wildtypform mit ihrer nativen tracrRNA, die sich mit der Schnittstelle der Guide-Cas9-Interaktion vergleicht, die größtenteils außerhalb der PI-Domäne liegt.

Genombearbeitung mit iSpyMac

eine CRISPResso2-Indel-Analyse nach NGS amplifizierter Genomregionen zur Beurteilung der Zielbearbeitung von iSpyMac im Vergleich zu SpyMac und SpyCas9 auf den angegebenen 5\(^{\prime}\)-NAA-3\(^{\prime}\) und 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{prime}\) – NGG-3\ (^\prime}\) PAM-Sequenzen. Die Proben wurden durchgeführt in zwei unabhängige Transfektion Wiederholungen (n = 2). b Effizienz heatmap der mismatch-Toleranz-Assays auf genomische Ziele., Quantifizierte Indel-Frequenzen, wie sie vom TIDE algorithm41 bewertet werden, werden für jede markierte einzelne oder doppelte Nichtübereinstimmung in der sgRNA-Sequenz für die angegebene Cas9-Variante und die angegebene PAM-Sequenz ausgestellt. Die Proben wurden durchgeführt in zwei unabhängige Transfektion Wiederholungen (n = 2). c CRISPResso2 genomische Basis-editing-Analyse folgende NGS der genomischen amplifikate zu beurteilen, conversion of cytosines zu thymines von iSpyMac-LE3. Die Proben wurden durchgeführt in zwei unabhängige Transfektion Wiederholungen (n = 2). Alle Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.,

Als nächstes bewerteten wir die Toleranz von iSpyMac gegenüber nicht übereinstimmenden Sequenzen, indem wir sgRNAs einsetzten, die doppelte oder einzelne Nicht Übereinstimmungen mit einem festen Protospacer innerhalb des AAVS-Gens enthielten und eine PAM-Sequenz von 5\(^{\prime}\) – GAAG-3\(^{\prime}\) besaßen. iSpyMac demonstrierte Bearbeitungsfunktionen für Ziele mit einzelnen Nichtübereinstimmungen innerhalb des PAM-proximalen Segments der sgRNA., Um diese vermeintliche Off-Target-Neigung zu mildern, haben wir die R691A-Mutation eingeführt, die zuvor über bakterielle Selektion für SpyCas9 isoliert wurde, um eine hohe On-Target-Aktivität aufrechtzuerhalten und gleichzeitig die Off-Target-Editing35 zu reduzieren. Unsere High-Fidelity-Variante, HiFi-iSpyMac, zeigte im Vergleich zum ursprünglichen Enzym eine nahezu vernachlässigbare Aktivität bei nicht übereinstimmenden Sequenzen mit minimalem Verlust der On-Target-Aktivität (Abb. 3b).,

Zuletzt wählten wir ein Fenster mit vier Nukleotiden im VEGFA-Locus in einem Sequenzkontext so aus, dass jede andere CRISPR-Endonuklease mit gemeldeter Verwendung für die Basenbearbeitung ihre Basenbearbeitung mit einem Cytidin-Deaminase-verschmolzenen Enzym nicht erlaubt36. Dementsprechend haben wir HEK293T-Zellen mit einer Nickase-Form von iSpyMac übertragen, die von der zuvor berichteten BE3-Architektur für die Cytosinbaseneditierung (iSpyMac-BE3) abgeleitet ist, und das sgRNA-Plasmid, das auf eine PAM stromabwärts der ausgewählten Nukleotide abzielt5., Wir haben effektive Basen-Editing-Spiegel in geernteten Zellen gemessen, die über 20% Cytosin-Thymin-Umwandlung an diesen Positionen über NGS-Analyse zeigten (Abb. 3c).