Durchflusszytometrie vs Facs

Durchflusszytometrie vs. FACS: Was ist der Unterschied?

Durchflusszytometrie und FACS (Fluorescence activated cell Sorting) sind deutlich unterschiedliche Verfahren, obwohl FACS ein Nachkomme-Verfahren ist, das auf Durchflusszytometrieprotokollen basiert. Fortschritte in der Zellsortierungstechnologie tragen in hohem Maße zur molekularwissenschaftlichen Landschaft bei., Der Gesamtbeitrag dessen, was gelernt wird, leitet den pharmazeutischen Entdeckungsprozess sowohl in diagnostischer als auch in therapeutischer Hinsicht, was wiederum zu verbesserten Patientenergebnissen führt1.

Was ist Durchflusszytometrie?

Die Durchflusszytometrie ist eine Methode zur Untersuchung und Bestimmung der Expression intrazellulärer Moleküle und der Zelloberfläche sowie zur Definition und Charakterisierung verschiedener Einzelzelltypen. Es wird auch bei der Bestimmung des Zellvolumens, der Zellgröße und der Bewertung der Reinheit von isolierten Subpopulationen verwendet., Dies ermöglicht die Mehrparameterauswertung einzelner Zellen etwa zur gleichen Zeit.

Eine Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Instrument, da sie die gleichzeitige Analyse von physikalischen und chemischen Eigenschaften von bis zu Tausenden von Partikeln pro Sekunde ermöglicht. Dies macht es zu einer schnellen und quantitativen Methode zur Analyse und Reinigung in Zellsuspension. Mit Flow können wir den Phänotyp und die Funktion bestimmen und sogar lebende Zellen sortieren., i

Einige der Messanwendungen, die über die Durchflusszytometrie durchgeführt werden, umfassen:

• Thrombozytenfunktion
• Knochenmark
• Peripheres Blut

Zu den beiden möglichen Durchflusszytometrie-Datenausdrucksformaten gehören:

• Histogramme, die nur einen einzelnen Parameter messen oder vergleichen,
• Punktdiagramme, die 2 oder 3 Parameter gleichzeitig auf einem zwei – oder dreidimensionalen Streudiagramm vergleichen.

Was ist FACS?,

FACS ist eine Abkürzung für fluoreszenzaktivierte Einzelzellsortierung, eine Durchflusszytometrietechnik, die einen weiteren Grad an Funktionalität hinzufügt. Durch die Verwendung hochspezifischer Antikörper, die mit fluoreszierenden Konjugaten (einem fluoreszierenden Molekül namens Fluorochrom) markiert sind, können wir mit der FACS-Analyse gleichzeitig Daten über eine biologische Probe sammeln und nach einer nahezu unbegrenzten Anzahl verschiedener Parameter sortieren. Genau wie in der herkömmlichen Durchflusszytometrie werden Vorwärtsstreuungs -, Seitenstreuungs-und Fluoreszenzsignaldaten gesammelt.,i

Unter Verwendung einer Durchflusszytometermaschine werden Zellen oder andere Teilchen, die in einem Flüssigkeitsstrom suspendiert sind, durch einen Laserstrahl in einer einzigen Dateiweise geführt, und Wechselwirkung mit dem Laserlicht wird durch eine elektronische Lichtdetektorvorrichtung als Lichtstreuungs-und Fluoreszenzintensität gemessen. Wenn ein Fluoreszenzmarker an eine zelluläre Komponente gebunden ist, stellt die Fluoreszenzintensität idealerweise die Menge dieser bestimmten Flusszellenkomponente dar.

Die Zellsortierung über Advanced cell sorting Instrumentation wird mit hoher Spezifität und hohen Standards durchgeführt., Forscher verwenden gerne die Durchflusszytometriemethoden, da dies der schnellste und effektivste Weg ist, die Messung auf den gesamten Zellprozess anzuwenden. Der Operator bestimmt oder wählt bestimmte Parameter vor, wie Zellen sortiert werden sollen. i

An dieser Stelle legt die Zellsortiermaschine jeder Zelle eine elektrische Ladung auf, so dass die Zellen beim Verlassen der Strömungskammer nach Ladung (unter Verwendung von Elektromagneten) in separate Gefäße sortiert werden. Die Technologie, um eine heterogene Mischung von Zellen physisch in verschiedene Populationen zu sortieren, ist für viele therapeutische und klinische Anwendungen nützlich.,

Verständnis der Beziehung zwischen FACS und Durchflusszytometrie

Um die Beziehung zwischen FACS-Analyse und Durchflusszytometrie in einem einfachen Kontext darzustellen, sind sie im Wesentlichen Partner im Zellanalyseprozess. FACS wird als Zellsortierer verwendet und für eine Teilmenge von Zellen angereichert, die dann häufig mit Durchflusszytometrie oder anderen Analysetechnischen2 genauer untersucht wird.

Die Durchflusszytometrie wird für die Zellanalyse verwendet und konzentriert sich auf die Messung der Proteinexpression oder Koexpression innerhalb einer gemischten Zellpopulation., Sowohl die Durchflusszytometrie als auch die FACS wurden entwickelt, um Zellen nach ihren optischen Filtern zu differenzieren.

Der Hauptunterschied zwischen den beiden Zellcharakterisierungsmodalitäten liegt in der Funktionalität der verwendeten Methode.

Sowohl die Durchflusszytometrie als auch die FACS werden tendenziell austauschbar verwendet. Sie sind beide entwickelt, um Zellen nach ihren optischen Eigenschaften zu differenzieren. Es gibt jedoch einige Unterschiede in der Methodik, die unterschiedlich sind und unterschiedliche Verfahrensergebnisse haben., Einzeln verwendet Die Ergebnisse sind einseitig, und zusammen verwendet, sind die Ergebnisse Expressionsdaten aus mehreren Zellenparametern3.

–FACS ist ein Verfahren, bei dem eine Probenmischung von Zellen nach ihren Lichtstreuungs-und Fluoreszenzeigenschaften in zwei oder mehr Behälter sortiert wird.

–Die Durchflusszytometrie ist eine Methode, die bei der Analyse einer heterogenen Zellpopulation nach verschiedenen Zelloberflächenmolekülen, Größe und Volumen verwendet wird und die Untersuchung einzelner Zellen ermöglicht.,

– FACS kann zusammen mit der Durchflusszytometrie mehrere Zellgenerationen messen und charakterisieren, indem hochspezifische Antikörper verwendet werden, die mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind, ein Forscher kann eine FACS-Analyse durchführen und gleichzeitig Expressionsdaten sammeln und Zellproben nach einer Reihe von Variablen sortieren.

Wie Durchflusszytometrie und FACS in klinischen Anwendungen eingesetzt werden

Immunphänotypisierung: Eines der häufigsten Anwendungsformate ist die Immunphänotypisierung. Dies ist eine Methodik, die mehrere Zellpopulationen in einer heterogenen Probe identifiziert und quantifiziert., Dazu gehören peripheres Blut, Knochenmark und Lymphmaterial. Immunphänotypisierung wird in erster Linie in hämatologischen Einstellungen verwendet, um bestimmte Krebsarten zu diagnostizieren, d. H. maligne Lymphome und / oder Leukämie4.

Zellsortierung: Fortschritte bei Zellsortiergeräten sind auf die schonende Isolierung von Zellen in separate Röhrchen ausgerichtet. Spezialisierte Durchflussmesser mit der Fähigkeit, jede Zelle beim Durchlaufen des Lasers abzufragen und zu charakterisieren und wichtige Messdaten der Zelle auszudrücken., Der Schlüssel wird hier auch quantitativ gemessen – die Instrumentierung kann große Volumina verarbeiten, die die mikroskopische Untersuchung überflüssig machen.

Zellzyklusanalyse: Mit Durchflusszytometrie und FACS kann die Zelle in allen vier verschiedenen Phasen des gesamten Zellzyklus analysiert und gemessen werden. Die zellbasierten Assays können dann bei der Bestimmung von Zellanomalien mit bestimmten Fluoreszenzfarbstoffen helfen. Das Feld der Einzelzellgenomik verwendet beide Methoden, um einen einzelnen Zelltyp für eine Zellpopulation zu untersuchen.,

Apoptose: Apoptose oder programmierter Zelltod ist ein normaler Teil des Lebenszyklus eukaryotischer Zellen. Zellen sterben aus verschiedenen Gründen: durch Nekrose, hervorgerufen durch äußere physikalische und chemische Veränderungen in der Zelle oder durch Apoptose, einen Prozess, bei dem Zellen durch intern kontrollierte Faktoren ein „Selbstmord“ – Programm einleiten. Diese beiden unterschiedlichen Arten des Zelltods, Apoptose und Nekrose, können mittels durchflusszytometrischer Methoden identifiziert und zur Bestimmung morphologischer, biochemischer und molekularer Veränderungen in sterbenden Zellen verwendet werden.,

Zellproliferationsassays: Zellbasierte Assays sind eines der wichtigsten Instrumente zur Messung der Wirkungsmechanismen auf bestimmte Reize wie Wachstumsfaktoren, Zytokine und andere Medienkomponenten. Das Durchflusszytometer kann die Proliferation messen, indem ruhende Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff der Zellmembran, Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE), gekennzeichnet werden. Wenn die Zellen aktiviert werden, beginnen sie sich zu vermehren und Mitose zu erleiden. Wenn sich die Zellen teilen, wird die Hälfte des ursprünglichen Farbstoffs an jede Tochterzelle weitergegeben., Durch die Messung der Reduktion des Fluoreszenzsignals können Forscher die zelluläre Aktivierung und Proliferation berechnen.

Intrazellulärer Calciumfluss: Zellen interagieren in ihrer Umgebung über Signaltransduktionswege miteinander. Wenn diese Wege aktiviert werden, pumpen membrangebundene Calciumionenkanäle Kalzium in die Zelle und erhöhen schnell die intrazelluläre Calciumkonzentration. Die höheren Kalziumspiegel versorgen die Zelle mit Energie, um zu reagieren. Das Durchflusszytometer ist in der Lage, den Fluss von Kalzium in die Zelle zu erfassen und detaillierte Messdaten bereitzustellen5.,

Die Erweiterung der durchflusszytometrischen Techniken zur Bewertung intrazellulärer Eigenschaften versetzt diese Plattform in die Arena der Bestimmung der Zellfunktion. Diese neueren Ansätze erweitern den Nutzen der Durchflusszytometrie als wertvolles Werkzeug für ein tieferes Verständnis der Immunfunktion und der Rolle bestimmter Zellen, wenn sie beginnt, Indikatoren für Apoptose aufzudecken., Durch die Verbesserung der Zelllebensfähigkeit durch verbesserte Technologie und das Erkennen des Zelltods oder der Apoptose hilft die Technologie den Forschern zu verstehen, warum dies geschieht und welche biochemischen Veränderungen spezifisch für jede Phase der Zellaktivität auftreten. Das Kartieren der Signalwege und der DNA-Fragmentierung ist eine Technik, die Molekulargenetiker als sehr wertvoll empfinden. mRNA-basierte therapeutische Lösungen scheinen der Schlüssel zur Lösung einiger der mit systemischen Erkrankungen verbundenen Rätsel zu sein6.,

Wenn wir uns der Möglichkeit nähern, den Zellanalyseprozess mittels 3D-Technologie zu nutzen, ist es leicht zu erkennen, wie das gewonnene Wissen zu mehr Innovation führen wird. Die Forschungsgemeinschaft freut sich darauf, die Decke der Molekularwissenschaft auf die Stammzelltechnologie auszudehnen. Mit Stammzellen und der Fähigkeit, sie effektiv zu klonen und sie in den Körper einzuführen, um Systemwechsel zu schaffen, geht die Zukunft., Wir können sehen, wie die Durchflusszytometrie und die unterschiedliche Methodik von FACS letztendlich zu positiveren Patientenergebnissen, therapeutischen Interventionen und möglicherweise eintägiger vollständiger Lyse von Krebstumoren führen werden. Genetische Krankheiten werden schnell aufgedeckt und die Ausstellung vieler neuartiger Entdeckungen hat eine neue Bewegung der biologischen und molekularen Wissenschaften eingeleitet7.

Quellen:

2 2https://www.sciencedirect.,com/science/article/abs/pii/0022175981902532

3 https://sciencing.com/understand-flow-cytometry-results-5805206.html

4 https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/immunophenotyping

5 https://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1177/1087057104264038

6 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4623474/

7 https://www.nature.com/scitable/topicpage/cdk-14046166/