Experimentelle Verifizierung von Modellen
Der erste Ansatz (3) identifizierte die primären Initiationsstellen in 14 Proteinen, einschließlich Rinder-Pankreas-RNase A und Pottwal-Myoglobin, sowie andere weniger stabile Initiationsstellen (11) in RNase A. Die primäre Initiationsstelle für RNase A wurde in diesem Modell als Rückstände 106-118 identifiziert. Die Anwendung des zweiten Ansatzes (8) auf die RNase A (13) führte zu sechs Stellen (Abb., 3 a), die mit denen übereinstimmten, die durch den ersten Ansatz (3) identifiziert wurden (11). Dies sind Rückstände 4-11 (Region A), Rückstände 25-34 (Region B), Rückstände 51-57 (Region C) und Antiparallelstrukturen (nicht notwendigerweise Faltenblätter), die durch die Assoziation von Rückständen 53-67 mit Rückständen 69-79 (Region D) gebildet werden, Rückstände 71-90 mit Rückständen 91-111 (Region E) und Rückstände 103-111 mit Rückständen 115-124 (Region F). Die nachfolgenden Schritte entlang des Faltweges bestehen aus dem Wachstum oder der Koaleszenz dieser Regionen. Region G wird gebildet, wenn sich Rückstände 36-48 gegen Helix B falten., Region G enthält jedoch Kontakte mit größerer Reichweite als Helix B. Daher wird davon ausgegangen, dass sich G zu einem späteren Zeitpunkt als B bildet B. Region L wird durch Assoziation der Region A mit B, G und C gebildet. Auf diese strukturelle Sequenz folgt Region H, gebildet, wenn die Regionen C und D in Kontakt kommen; nach Region K, die Kontakte zwischen den Regionen E und F enthält; nach Region J, in der die Regionen C und D Kontakte mit den Regionen E und F bilden; und nach Region I, die Kontakte der Regionen E und H mit G. Schließlich wird Region M gebildet,,
Die vorhergesagte primäre Faltungsinitiationsstelle der RNase A stimmt mit der beobachteten Wendung an den Resten 113 und 114 im nativen Molekül überein, wobei der sehr hohe Erhaltungsgrad unpolarer Reste an der Stelle 106-118 von 23 Säugetierarten dieses Proteins (3) und mit experimentellen Informationen über Zwischenprodukte, die bei der thermischen Entfaltung der RNase A (14) nachgewiesen wurden, überein., NMR-Nachweis für lokale Struktur in entfalteter RNase A unter Faltbedingungen (15) und in Fragmenten davon (16) sowie immunochemische Studien zur Bildung stabiler antigener Stellen (auf der Oberfläche des Proteins, die die vergrabene primäre hydrophobe Initiationsstelle abdecken, wenn reduzierte RNase A oxidiert wird (ref. 17 und Abbildung 8 von ref. 18), stimmten auch mit diesem Bild überein. Weitere experimentelle Beweise für die Existenz von Initiationsstellen A-F sind in ref. 11.,
Bei Apomyoglobin identifizierte der erste Ansatz (3) die primäre Faltungsinitiationsstelle als Rückstände 103-115, die den Hauptteil der G-Helix umfasst, mit der Sequenz Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-Ser-Glu-Ala-Ile-Ile-His-Val-Leu., Die Anwendung des zweiten Ansatzes (8) und der Konformations-Energie-Berechnungen führte zu dem Vorschlag, dass Wechselwirkungen zwischen den A -, G-und H-Helices von Apomyoglobin für die Faltungsinitiation wichtig sein könnten (19), im Einklang mit experimentellen Ergebnissen, die diese Regionen in Gleichgewichtszwischenprodukte von Apomyoglobin (20) und in die frühesten kinetischen Schritte im Faltweg (21). Jüngste experimentelle Studien von Mutanten von Myoglobin (22, 23) liefern überzeugende Unterstützung für Modelle, die hydrophobe Initiation und Ausbreitung der Faltung beinhalten.,
Apomyoglobin ist zu einem Paradigma für die Erforschung von Faltwegen geworden (24). Ein Teil des Apomyoglobinmoleküls, bestehend aus den A -, G-und H-Helices und einem Teil der B-Helix, faltet sich schnell zu einem Zwischenprodukt auf dem Weg, wobei der Rest der Polypeptidkette langsamer faltet in der Größenordnung von Sekunden (21, 25). Peptidfragmente von Apomyoglobin, die den G-und H-Helices entsprachen, zeigten eine Neigung zur helikalen Struktur (26-28), während Peptide, die dem Rest des Proteins entsprachen, eine weitaus geringere Neigung zur Helix-Bildung zeigten (29)., Ein Experiment, bei dem die H-Helix von Myoglobin mutiert wurde, um seine helikale Neigung zu verringern (30), zeigte jedoch nur einen sehr geringen Einfluss auf die Faltungsrate des Proteins. Ein viel größerer Effekt wurde beobachtet, wenn das distale Histidin (H64) in Phenylalanin umgewandelt wurde: Die Substitution einer unpolaren Seitenkette für das vergrabene polare Histidin führte zu einer signifikanten Erhöhung der Faltrate (31). Diese Studien wiesen auf die Bedeutung der Seitenkettenpackung, insbesondere in den Kontaktflächen von Helices, für die Faltungsrate von Apomyoglobin hin.,
Apomyoglobin hat den Vorteil, dass es im Gleichgewicht unter einer Reihe von Lösungsbedingungen untersucht werden kann, die einige der beobachtbaren Stadien auf dem kinetischen Faltweg annähern. Somit war es möglich, die Konformationsneigung von entfaltetem und teilweise gefaltetem Apomyoglobin durch NMR (32-35) zu definieren. Interessanterweise zeigt säurefaltetes Apomyoglobin eine Neigung zur nicht-nativen helikalen Struktur in einem Bereich, der die D-und E-Helices verbindet, sowie die in den A-und H-Helices beobachtete nativartige Struktur, die in den kinetischen Studien vorhergesagt worden war (34)., Die NMR-Studien der Konformationsneigung der verschiedenen Formen von Apomyoglobin (32-35) umfassten die Bestimmung der Relaxationsparameter der Polypeptidkette zur standortspezifischen Bestimmung der Rückgratdynamik in jedem der Zustände des Proteins. Anstelle der „modellfreien“ Analyse, die für gefaltete Proteine geeignet ist, wurden die Relaxationsdaten durch Berechnung der reduzierten spektralen Dichtefunktionen J(0), J(wN) und J(wH) (36) analysiert. Die Funktion J (0) informiert über µs–ms Zeitskala Bewegungen und schlug vor, dass für Apomyoglobin bei pH 2.,3 machten die A-und G-Helices vorübergehende Kontakte (34). Dieses spannende Ergebnis, das später durch Spin-Label-NMR-Studien validiert wurde (37), lieferte definitive Beweise für native Langstreckenkontakte in einem entfalteten Protein. Noch interessanter ist, dass die Funktion J(wN), die über ps–ns Zeitskala Bewegung informiert, zeigte sequenzabhängige Variation, die mit Variation in einem berechneten Parameter korreliert werden könnte, die „average area buried upon folding“ (AABUF) (10)., Dieser Parameter, der sowohl die Rückstandsgröße als auch die Hydrophobie umfasst, ist für einzelne Aminosäuren definiert, wird jedoch üblicherweise über ein Fenster von fünf bis neun Resten in der Sequenz gemittelt und liefert eine alternative quantitative Schätzung der Hydrophobie, die von Matheson und Scheraga (3) in Bezug auf die freie Energie der Bildung definiert wird. Im Falle von Apomyoglobin bei pH 2,3, Peaks im Plot von J (wN) vs., die Rückstandszahl, die eine Einschränkung der Sub-ns-Zeitskala-Bewegung anzeigt, entsprach äußerst gut den Peaks im AABUF-Plot, die auf eine überdurchschnittlich hohe Anzahl großer und/oder unpolarer Aminosäuren hindeuten. Diese Beobachtung deutete darauf hin, dass es in der Aminosäuresequenz ein Muster gibt, das durch Gruppierungen großer und/oder unpolarer Seitenketten definiert ist, wie im Modell von ref. 3, was zu einer Einschränkung der Bewegung des Polypeptid-Rückgrats führt, die durch lokale hydrophobe Clusterbildung verursacht wird.
Apomyoglobin bei pH 2.,3 behält eine geringe Neigung zur helikalen Struktur in den A-und H-Helices bei, wie durch die beobachteten NMR-chemischen Verschiebungen beurteilt (34). Diese Neigungen werden in Gegenwart von 8 M Harnstoff (35) abgeschafft, doch zeigt auch die Sequenzabhängigkeit der Relaxationsraten von harnstoffdenaturiertem Apomyoglobin eine faszinierende Korrelation mit dem AABUF-Parameter. In diesem Fall besteht die Korrelation zwischen Minima in J (wH) und Maxima von AABUF, was darauf hindeutet, dass lokale hydrophobe Wechselwirkungen, die die Rückgratbewegung auf Sub-ns-Zeitskalen einschränken, auch in 8 M Harnstoff persistent sind.,
Um die Hypothese zu testen, dass der AABUF-Parameter, d. H. Die Hydrophobie, zur Vorhersage der Faltungsinitiationsstellen in der Polypeptidkette verwendet werden könnte, wurde ein spezifischer Satz von Apomyoglobin-Mutationen vorgenommen (23). Die A-Helix, die an dem kinetischen Zwischenprodukt beteiligt ist, das zuerst bei der Faltung des Apomyoglobins gebildet wird, weist eine Sequenz auf, die im AABUF-Parameter ein Maximum ergibt, während die E-Helix, die nach herkömmlichen Hydrophobikeskalen tatsächlich stark hydrophob ist, über ihre gesamte Länge einen eher niedrigen AABUF aufweist., Im gefalteten Apomyoglobin liegt die Seitenkette von Trp-14, in der A-Helix, gegenüber dem Rückgrat der E-Helix bei Gly-73. Es wurde ein doppelmutantes Myoglobin hergestellt, bei dem Trp-14 durch Gly und Gly-73 durch Trp ersetzt wurde. Es wurde argumentiert, dass die gefaltete Struktur des Proteins durch diesen Swap minimal gestört werden sollte, dass jedoch der AABUF-Parameter für die A-und E-Helices drastisch beeinflusst werden sollte. Die Frage sei, ob auch der Faltweg betroffen sei. In der Tat erfolgt die Faltung der Mutante, in der G73 und W14 ausgetauscht werden, über einen anderen Weg als das WT-Protein., Alle bisher untersuchten Apomyoglobin-Varianten falten sich über ein Burst-Phase-Intermediat, das eine helikale Struktur enthält. Im Falle von WT-Apomyoglobin enthält dieses Zwischenprodukt die A -, G-und H-Helices (und auch einen Teil der B-Helix). In der G73-W14-Swap-Mutante enthält das Zwischenprodukt die E -, G-und H-Helices; Die A-Helix ist in der Anfangsphase der Faltung nicht geschützt, sondern faltet sich später. Dieses Ergebnis (dargestellt in Abb. 4) wurde durch Spin-Label-Studien bestätigt, die Kontakte zwischen den E -, G-und H-Helices in der Mutante anstelle der im WT-Protein beobachteten A -, G-und H-Kontakte zeigten.,