En Identifikation af, ER Elementer i E. coli
ER elementer blev først opdaget af de virkninger, der er forårsaget hvis disse elementer er integreret i lac (Malamy, 1966, 1970) og gal operons (Saedler og Starlinger, 1967a,b; Jordan et al., 1967; Adhya og Shapiro, 1969) af E. coli og ind i den tidlige højre operon af dens bakteriofag lambda (Brachet et al., 1970)., Elementerne forårsager en null-mutation af genet, som de integreres i, og en meget stærk polær effekt på alle gener af operonen placeret distalt til det muterede gen. Mutationerne vender tilbage til den vilde type spontant, men hyppigheden af reversion kunne ikke forbedres af mutagener. Dette rejste mistanken om, at mutationerne ikke var punktmutationer, men DNA-omlejringer.,
det kunne påvises, at mutationen tilføjede DNA til gal-operonen ved at sammenligne densiteten af transducerende lambda dgal-bakteriofag, som bar eller ikke Bar mutationen og ellers var isogen (Jordan et al., 1968; Shapiro, 1969). Dette udelukkede muligheden for, at mutationerne var forårsaget af en inversion af DNA. For at skelne mellem de to resterende muligheder, duplikering af en del af gal operon eller indsættelse i denne operon af ikke-relateret DNA, Michaelis et al., (1969) sammenlignede det muterede og det ikke-muterede DNA ved at hybridisere RNA transkriberet fra mutanten til enten DNA. Disse eksperimenter viste tydeligt, at det ekstra DNA, der blev fundet i mutanterne, ikke var afledt af gal operon. Derudover kunne det vises, at det ekstra DNA i to uafhængige mutanter delte mindst nogle af disse sekvenser. Dette rejste muligheden for, at mutanterne ikke var forårsaget af indsættelse af tilfældige segmenter af E. coli DNA, men snarere ved transponering af specifikke transposerbare elementer.,
denne hypotese blev vist at være sand, da et større antal mutanter blev undersøgt ved at indsætte heteroduple.DNA-molekyler i elektronmikroskopet (Fiandt et al., 1972; Hirsch et al., 1972a,b; Malamy et al., 1972). Fire forskellige elementer kunne identificeres på det tidspunkt. De blev kaldt indsættelse sekvenser (er) og nummereret fortløbende IS1 til IS4. IS1 er cirka 0,8 Kb (kilobaser) lang. Den anden er elementer har en længde på omkring 1,5 Kb. Et femte element, IS5, af samme størrelse (Blattner et al.,, 1974) og et større element på lidt mere end 5 Kb, som af historiske grunde kaldes γ-((Guyer, 1978), er blevet påvist siden, men antallet ser ud til at være nær mætning for E. coli K12.
inden for begrænsningen af elektronmikroskopet deler de forskellige IS-elementer ikke sekvenser, mens forskellige isolater af det samme element er identiske. Dette udelukker naturligvis ikke små sekvensforskelle mellem sidstnævnte.,
Hybridisering af passende DNA enkelt tråde deling kun ER element i supplerende form, efterfulgt af fordøjelsen med single-strand-specifikke nucleaser tillade, at isolation af, ER DNA-i ren form (Ohtsubo og Ohtsubo, 1976; Schmidt et al., 1976). Den hurtige udvikling af DNA-begrænsning analyse og sekventering metoder, der faktisk har tilladt, at opgørelsen af den komplette sekvens af IS1 (Ohtsubo og Ohtsubo, 1978; Johnsrud, 1979), og IS2 (Ghosal et al., 1979a). Sekvensen af IS4 er næsten færdig på tidspunktet for skrivningen af dette kapitel (R. Klaer et al ., upublicerede eksperimenter).,
DNA–DNA-hybridiseringsteknikker er blevet anvendt til at søge efter tilstedeværelsen af is-elementer i E. coli-kromosomet. IS1 og IS2 findes i henholdsvis 8 8 og 5 5 eksemplarer (Saedler og Heiss, 1973). Anvendelsen af Southern ‘ s blotting-teknik tillod den nøjagtige bestemmelse af kopiantallet af IS3 i E. coli K12 og af IS4 . Derudover blev nogle af IS-elementerne vist at blive båret på E. coli-fertilitetsplasmidet f (Davison et al., 1975a), og på nogle R faktorer (Hu et al ., 1975).,
is-elementerne er ikke kendt for at kode gener, der oversættes til proteiner, men i tilfælde af IS1 udelukker den kendte DNA-sekvens ikke muligheden for oversættelsen til et (få) peptid (er) af begrænset størrelse. Længden af IS-elementerne udelukker dannelsen af store proteiner. De kendte virkninger af is-elementer er derfor begrænset til positionen, hvor de er integreret, og til tilstødende DNA-sekvenser i position cis. Disse effekter er beskrevet i de følgende afsnit.
en anden klasse af transposerbare DNA-elementer er blevet beskrevet siden 1974., De kaldes transposoner. Som regel er de større end elementer og detekteres af effekter, der er forårsaget af protein kodet i transposon DNA. De første beskrevne transposoner koder for resistens over for antibiotika, og de fleste kendte transposoner bærer resistensgener (Datta et al., 1971; Hedges and Jacob, 1974; for anmeldelser, Se Cohen, 1976; Kleckner, 1977). Der er dog transposoner, der koder for et E. coli enteroto .in (så et al., 1979)eller gener til laktosefermentering (Cornells et al., 1979)., Tn3 bærer ud over at bære et gen for β-lactamase også gener involveret i transpositionsprocessen (Heffron et al., 1977; Gill et al., 1978; Chou et al., 1979). Det samme synes at være tilfældet for Tn5(Berg et al ., 1978).
transposoner findes i naturen som dele af plasmider. Transponeringen mellem plasmider forklarer variabiliteten fundet med hensyn til multipel lægemiddelresistens af forskellige plasmider. I laboratoriet er transposition til genomet af bakteriofag blevet påvist såvel som transposition til det bakterielle kromosom., Ingen af de kendte transposoner er imidlertid en naturlig bestanddel af E. coli K12-kromosomet.
litteraturen om transposoner ekspanderer hurtigt, og for en beskrivelse af de mange forskellige transposoner, der er kendt på tidspunktet for skrivningen af denne artikel, henvises læseren til mere omfattende anmeldelser af dette emne.
alle transposoner, der hidtil er undersøgt, har en fælles struktur: de bærer en gentagen DNA-sekvens ved deres termini og unikt DNA, der koder for gener mellem disse gentagne DNA-sekvenser. I de fleste tilfælde inverteres de gentagne DNA-sekvenser i forhold til hinanden., Deres størrelse er variabel. I nogle transposoner omvendt gentagelser er omkring 1,5 Kb, og der er grund til at formode, at disse sekvenser er uafhængigt transposoner ER elementer. 0,15 Kb (f.TN1–3, der koder for ampicillinresistens (Heffron et al., 1975; Kopecko og Cohen, 1975).
I tilfælde af Tn9, kodning resistens over for chloramphenicol (McHattie og Jackowski, 1977), og Tn1681, kodning af E. coli enterotoxin (Så et al., 1979), er sekvensen gentaget ved termini IS1., I sidstnævnte tilfælde er de to kopier af IS1 omvendt relativt til hinanden, mens de to IS1-kopier i førstnævnte tilfælde er direkte gentagelser. Som det er kendt fra DNA-sekvensen af IS1, at dette element i sig selv afsluttes med små uoverensstemmende DNA-gentagelser, bevares den generelle regel om, at selve termini for transposoner er inverterede gentagelser, selv for TN9. Faktisk i tilfælde af IS2 (Ghosal et al., 1979a) og IS4 (Habermann et al., 1979), findes inverterede gentagelser på deres termini., Den generelle betydning af denne observation kan endda indebære en rolle af disse inverterede gentagelser i gennemførelsesprocessen.