dette materiale ledsages af en præsentation om proteinstruktur og principper bag denaturering af prøver og diskontinuerlig gelelektroforese.
adskillelsen af makromolekyler i et elektrisk felt kaldes elektroforese. En meget almindelig metode til adskillelse af proteiner ved elektroforese bruger en diskontinuerlig polyacrylamidgel som et støttemedium og natriumdodecylsulfat (SDS) til denaturering af proteinerne. Metoden kaldes natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE)., Det mest anvendte system kaldes også Laemmli-metoden efter U. K. Laemmli, som var den første til at udgive et papir, der anvender SDS-PAGE i en videnskabelig undersøgelse.
SDS (også kaldet laurylsulfat) er et anionisk vaskemiddel, hvilket betyder, at når dets molekyler opløses, har dets molekyler en netto negativ ladning inden for et bredt pH-område. En polypeptidkæde binder mængder af SDS i forhold til dens relative molekylmasse. De negative ladninger på SDS ødelægger det meste af den komplekse struktur af proteiner og tiltrækkes stærkt mod en anode (positivt ladet elektrode) i et elektrisk felt.,
polyacrylamidgeler begrænser større molekyler fra at migrere så hurtigt som mindre molekyler. Da ladnings – til-masseforholdet er næsten det samme blandt SDS-denaturerede polypeptider, afhænger den endelige adskillelse af proteiner næsten udelukkende af forskellene i relativ molekylmasse af polypeptider. I en gel med ensartet densitet er den relative migrationsafstand af et protein (Rf, F som et abonnement) negativt proportional med loggen af dets masse., Hvis proteiner med kendt masse køres samtidigt med de ukendte, kan forholdet mellem Rf og masse afbildes, og masserne af ukendte proteiner estimeres.
proteinseparation ved SDS-PAGE kan bruges til at estimere relativ molekylmasse, til at bestemme den relative overflod af større proteiner i en prøve og til at bestemme fordelingen af proteiner blandt fraktioner. Renheden af proteinprøver kan vurderes og forløbet af en fraktionering eller oprensning procedure kan følges., Forskellige farvningsmetoder kan bruges til at detektere sjældne proteiner og lære noget om deres biokemiske egenskaber. Specialiserede teknikker såsom Western blotting, to-dimensional electrophoresis, og peptid kortlægning kan bruges til at opdage ekstremt knappe gen-produkter, for at finde ligheder mellem dem, og til at opdage og separat foreninger af proteiner.
Molekylmasse versus molekylvægt
Molekylmasse (symbol m) udtrykkes i Dalton (Da). En Dalton er defineret som 1/12 massen af kulstof 12., De fleste makromolekyler er store nok til at bruge kiloDalton (kDa) til at beskrive molekylmasse. Molekylvægt er ikke den samme som molekylmasse. Det er også kendt som relativ molekylmasse (symbol Mr, hvor r er en sænket). Molekylvægt er defineret som forholdet mellem massen af en makromolekyle til 1/12 massen af en carbon 12 atom. Det er en dimensionsløs mængde.
når litteraturen giver en masse i Da eller kDa, refererer den til molekylmasse. Det er forkert at udtrykke molekylvægt (relativ molekylmasse) i Dalton., Ikke desto mindre finder du udtrykket molekylvægt brugt med Dalton eller kilodalton i nogle litteratur, ofte ved hjælp af forkortelsen m.for molekylvægt.
polyacrylamidgeler til SDS-Page
mange systemer til proteinelektroforese er blevet udviklet, og apparater, der anvendes til SDS-Page, varierer meget. Den metode, der anvendes på disse sider, anvender Laemmli-metoden. Henvisning til Laemmli-metoden i et afsnit om materialer og metoder eliminerer behovet for at beskrive buffere, støbning af geler, apparater osv., Medmindre papiret anvender en vis ændring af metoden, er de eneste detaljer om SDS-side, der skal rapporteres i et metodeafsnit, procent total acrylamid (%T) i en gel, relativ procentdel og type krydsbinder (%C) og måske en henvisning til geldimensionerne. Vi bruger et” mini-gel “- system med 3 1/4″ 4 4 ” gelkassetter.
SDS-PAGE kan udføres på forstøbte geler, hvilket sparer problemer og fare for at arbejde med acrylamid. Følgende beskrivelse gælder for Shop-made støbning og kører apparater, der er meget billigere end kommercielt tilgængeligt udstyr., Ud over omkostningseffektivitet er en fordel ved at lave ens egne geler første gang en dybere forståelse af processen.
uanset systemet kræver forberedelse støbning af to forskellige lag acrylamid mellem glasplader. Det nedre lag (adskillelse eller opløsning af gel) er ansvarlig for faktisk at adskille polypeptider efter størrelse. Det øverste lag (stabling gel) indbefatter prøvebrøndene. Det er designet til at feje proteiner i en prøve mellem to bevægelige grænser, så de komprimeres (stablet) i mikrometer tynde lag, når de når separeringsgelen.,