Hvad er Polyacrylamidgelelektroforese (side)?

Elektroforese teknikker separat ladede molekyler i et elektrisk felt. Mobiliteten af et molekyle er omvendt proportional med dets størrelse og direkte proportional med dets ladning. Under elektroforese bevæger proteiner sig mod en modsat ladet elektrode i et elektrisk felt.,

hastigheden af deres bevægelse i et elektroforetisk system styres af flere faktorer, såsom temperatur, pH og bufferkoncentration ud over iboende egenskaber, såsom proteinernes størrelse, ladning og form.

elektroforetisk adskillelse af proteiner strengt på basis af deres molekylvægt er kun mulig, hvis ladningen af alle proteinmolekylerne kan manipuleres til samme tegn. I et sådant tilfælde vil proteinmolekylernes mobilitet udelukkende være afhængig af deres størrelse.,

Polyacrylamidgelelektroforese (side) er en teknik baseret på denne ide og bruges til at adskille proteiner på basis af deres størrelse.

principper for side

På side bruges et anionisk vaskemiddel kaldet natriumdodecylsulfat (SDS) til at binde til proteiner og give dem en negativ ladning. Proteiner separeres derefter elektroforetisk i henhold til deres størrelse ved hjælp af en gelmatri.fremstillet af polyacrylamid i et elektrisk felt.

polyacrylamid fremstilles som et resultat af polymerisationsreaktionen mellem acrylamid og N,N’-methylen-bis-acrylamid (BIS) under anvendelse af en katalysator., Graden af polymerisering eller tværbinding kan styres ved at justere koncentrationen af acrylamid og BIS.

jo mere tværbinding jo hårdere gelen. Hårdhed af gelen modulerer på sin side friktionen, der opleves af makromolekyler, når de rejser gennem gelen under siden, hvilket påvirker opløsningen af adskillelse.

løse geler (4-8% acrylamid) tillader molekyler med højere molekylvægt at migrere hurtigere gennem gelen, mens hårde geler (12-20% acrylamid) begrænser migrationen af store molekyler og selektivt tillader små at bevæge sig gennem gelen.,

SDS-sideprotokol

1. Prøvepræparation:

Proteinprøver denatureres ved opvarmning med et vaskemiddel SDS og mercaptoethanol. Førstnævnte binder stærkt til proteinerne og giver dem en høj negativ ladning, mens sidstnævnte frigør sulfhydrylgrupper, hvilket giver polypeptidkæder, der bærer en overskydende negativ ladning og lignende ladning til masseforhold. Dette hjælper opløsningen af proteiner strengt baseret på deres størrelse under gelelektroforese.

2., Gel forberedelse:

den elektroforetiske gel har normalt flere komponenter, herunder acrylamid, BIS og en buffer. Blandingen afgasses for at forhindre bobledannelse under polymerisering af gelen. Ammonium persulfat, en fri radikal kilde, og en stabilisator tilsættes for at starte polymerisering. BIS tilsættes også for at danne tværbindinger mellem acrylamidmolekyler, indtil der til sidst dannes en gel.

3. Elektroforese:

som en elektrisk strøm påføres proteiner migrere gennem gelen til den positive elektrode, da de har en negativ ladning., Hvert molekyle bevæger sig med en anden hastighed baseret på dets molekylvægt – små molekyler bevæger sig hurtigere gennem gelen end større. Migration er normalt hurtigere ved højere spændinger. Efter et par timer adskilles proteinmolekylerne alle efter størrelse.

4. Farvning og visualisering:

Når elektroforese er færdig, gel kan farves ved hjælp af farvede farvestoffer såsom Coomassie Brilliant Blue eller ethidiumbromid at gøre det udskilte proteiner, der vises som forskellige farvede bånd på gelen.

ubundet farvestof vaskes ud af gelen., De farvede geler tørres derefter, så farveintensiteten af proteinbåndene kan måles. Bånd af radioaktive proteiner kan detekteres ved autoradiografi. Proteinerne kan også kvantificeres, da proteinindholdet er direkte proportional med mængden af det bundne farvestof.

nogle gelsystemer introducerer et sporingsfarvestof som bromphenol blue sammen med proteinprøven – den synlige afstand, som farvestoffet på gelen tilbagelægger, hjælper med at bestemme den krævede varighed af elektroforese., Bromphenolblå rejser sammen med prøvemolekylerne, indtil den til sidst når bunden af gelen. Elektroforese skal stoppe på dette tidspunkt for at sikre, at ingen proteinmolekyler elektroforese ud af gelen og ind i bufferen.

Yderligere Læsning

• Alle Elektroforese Indhold
• Elektroforese som et Redskab i Retsvidenskab
• Typer af kapillarelektroforese

citater