Grænser i Veterinær Videnskab

Indledning

Hvirvelløse dyr, som omfatter cirka en million dyrearter, der holdes både i zoologiske institutioner og i hjemmene, hvor de er hævet hånd som eksotiske kæledyr (1). Snegle omfatter næsten 60.000 arter af akvatiske såvel som terrestriske bløddyr, primært snegle og snegle (1). Den gigantiske afrikanske landsnegl (Achatina fulica, syn., Lissachatina fulica) er hjemmehørende i Østafrika, men det er en udbredt invasiv art i Asien, Oceanien og for nylig i Amerika, hvor den er blevet introduceret ved et uheld eller målrettet som fødekilde og som kæledyr. Dens frigivelse i naturlige økosystemer, landbrugs-og byområder har resulteret i økologiske, sundhedsmæssige og landbrugsmæssige trusler (2, 3). Den gigantiske Afrikanske land sneglen er en mellemliggende værter for flere parasitter, herunder Aelurostrongylus abstrusus, Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus costaricensis, Schistosoma mansoni, Hymenolepis spp.,, og Fasciola hepatica (4, 5). Alle ovennævnte helminths, med undtagelse af A. abstrusus, er i stand til at forårsage alvorlige sygdomme hos mennesker. Specifikt er den gigantiske afrikanske landsnegl den vigtigste gastropod, der er ansvarlig for verdensomspændende spredning af A. cantonensis, der forårsager human eosinofil meningoencephalitis i Asien og Amerika (2, 6). Risikofaktorer for infektion hos mennesker, kæledyr og dyreliv med disse helminth parasitter omfatter indtagelse af rå eller undercooked inficerede snegle eller snegle, eller fødevarer forurenet med slim af inficerede snegle eller snegle (4, 5, 7, 8).,

selvom de afrikanske gigantiske snegle er blandt de mest populære snegle, der holdes som kæledyr, og deres verdensomspændende popularitet som eksotiske kæledyr vokser hurtigt, er der kun foretaget nogle få undersøgelser om forekomsten af deres parasitter under naturlige forhold (2, 6, 9-11). Formålet med denne undersøgelse var at undersøge forekomsten af parasitter i gigantiske afrikanske landsnegle opdrættet som kæledyr i det sydlige Italien.,

Materialer og Metoder

Generelle Data

I August 2018, tre puljer af frisk fækal indsamlede prøver fra i alt 60 giant Afrikanske land-snegle, holdt i tre forskellige private samlinger, der ligger i Pozzuoli, Caserta, og Napoli (Italien), blev undersøgt for parasitter. Fra hver lokalitet fik vi en pulje af afføring fra 20 individuelle snegle hver. Sneglene inkluderet i denne undersøgelse havde en medianalder på 1, 6 år fra 0, 2 til 2 år og havde ikke modtaget nogen tidligere anti-parasitisk behandling., Sneglene blev fodret med friske grøntsager og frugter; desuden et pulver calcium-tilskud (Calcium -, Exo-Terra, Hagen Deutschland GmbH & Co. KG, Holm, Tyskland) blev leveret to gange om ugen. Alle dyr, der blev avlet i Italien, privatejet og holdt som kæledyr i fire indendørs terrarier af 60 × 30 × 45 cm i størrelse, i grupper på 10-20 dyr (2 grupper af 20 snegle i Pozzuoli og Caserta og 2 grupper af 10 snegle hver i Napoli)., En økologisk tørvejord (Økologisk Coco-Tørvejord, E-Coco Produkter, Gloucestershire, STORBRITANNIEN), tidligere varmebehandlet (100°C i 30 min) og derefter fri for parasitter og insekter, der blev anvendt som substrat.

diagnostiske procedurer

tyve gram frisk afføring blev oprindeligt opnået fra hvert af de fire terrarium., Når der samles afføring analyseret af frisk smøre, flotation og Baermann test viste, positivitet til rhabditid nematoder, to snegle fra hver positiv terrarium var opstaldet individuelt i en steril plastik boks, og deres afføring er blevet indsamlet, umiddelbart efter afføring, i en steril 50 ml plastic rør. Coprologisk undersøgelse af samlede og individuelle prøver omfattede frisk udstrygning, centrifugalflotation (2 g afføring for hver test) under anvendelse af en opløsning af sukker og formaldehyd (specifik tyngdekraft 1.27) og Baermann-test (10 g afføring for hver test)., Derudover blev slimet opnået under frisk smøreundersøgelse analyseret under et lysmikroskop. Fordi larve former for flere helminth arter kan encyst inde i foden muscle af snegle, histologisk undersøgelse af biopsi-prøver, der er høstet fra den forreste og bageste områder af foden muskler blev udført i 30 snegle, bedøvet med den teknik, der er beskrevet af Giannelli et al. (12) og Gilbertson og Gilyatt (13)., Biopsi-prøver blev rettet i 10% neutral fosfat-buffered formalin, og behandles af rutinemæssige metoder i paraffinblokke, der blev skåret i 3 µm tykke sektioner, og der er farvet med hematoxylin og eosin. Undersøgelsen blev udført under tilladelse fra den praksis, hvor den fandt sted, og under underskrevet, skriftligt informeret ejer samtykke.

morfologisk identifikation

midlertidige monteringer blev foretaget ved varmedræbende nematoder på glasskinner i en dråbe vand, hvorefter der blev påført et glasdæksel., Nematoder blev overført til en dråbe ledningsvand på en glasskinne og anbragt på varmelegeme (100. C) i 10 s.disse prøver blev anvendt til morfologisk identifikation. En AMPLIVAL lysmikroskop, Carl .eiss Jena, og en Leit.Diaplan med Nomarski optik blev anvendt til observation., Morfologisk identifikation af rhabditid nematoder, der blev fulgt på Andrassy (14) og Andrassy (15) og det var for det meste baseret på morfologi, svælg og stomi, og reproduktiv system, primært funktionerne i spicules, antal og placering af papiller eller tilstedeværelsen og størrelsen eller formen af bursa for hanner; og hale form, position af vulva og morfologi i den i den reproduktive system er for kvinder. Identifikationen af larver var baseret på haleformen.

molekylær analyse

DNA blev ekstraheret fra nematodeprøver opnået fra fæces fikseret i 96% ethanol opsamlet fra de tre lokaliteter., Nematoder blev vasket i dobbeltdestilleret vand (ddh2o) natten over før molekylanalysen for fuldstændig fjernelse af rester af ethanol. Hver enkelt nematode var overføres til en steril Eppendorf-rør (200 µl) med 20 µl af udvinding buffer (17.7 µl ddH2O, 2 ĩl af 10 × koncentreret PCR buffer, 0.2 µl 1% Tween 20 og 0,1 µl af proteinase K). Buffer og nematoder blev frosset ved -20 C C i 20 minutter og derefter straks inkuberet ved 65 C C i 1 time efterfulgt af 10 minutter ved 95 C. C., Lysaterne blev afkølet på is og derefter centrifugeret (2 min, 9.000 g); 1 pi supernatant blev anvendt til PCR.

Et fragment af rDNA, som indeholder den interne transcribed spacer regioner (ITS1, 5.8 S, ITS2) blev forstærket ved hjælp af primere 18 ÅR: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′ (fremad), og 28S: 5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′ (reverse) (16). Et fragment af rDNA, der indeholder genet for 18S rRNA blev forstærket ved hjælp af primere 22F: 5′- TCC AAG GAA GGC AGC AG GC-3′ (fremad), og 1080JR: 5′- TCC TGG TGG TGC CCT TCC GTC AAT TTC-3′ (reverse) (17). PCR masterblandingen bestod af: ddH2O, 7.,25ll; 10 PCR PCR-buffer, 1,25 µl; deo .ynucleosidtriphosphater (dNTP ‘ er), 1LL; 0,75ll både frem og tilbage primer; polymerase, 0,1ll; og 1LL DNA-ekstrakt. PCR-profiler blev anvendt som følger: for SIN 1 cyklus af 94°C i op til 7 min. efterfulgt af 35 cyklusser af 94°C i 60 s, 50°C til 60 s og 72°C i 60 s, og en endelig forlængelse ved 72°C i op til 7 min (14); for 18S 1 cyklus af 94°C i 5 min, efterfulgt af 35 cyklusser af 94°C i 60 s, 55°C til 90 s og 72°C i 2 min. og en endelig forlængelse ved 72°C i 10 min., PCR produkterne blev sekventeret af GATC Biotech (Tyskland) og senere redigeret og uploadet til GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

resultater

Baermann-testen afslørede tilstedeværelsen af nematodelarver, hvis længde varierede fra 170 til 336 µm, i alle prøver. Æg, larver og voksne rhabditid nematoder blev påvist ved frisk smear og flotation metoder i alle fækale prøver. Rhabditella axei (Figur 1) blev identificeret morfologisk fra to ud af tre i en pulje og individuelle prøver fækalier fra Pozzuoli og Napoli. Derudover Rhabditis terricola, Cru .nema sp.,, og Pristionchus entomophagus blev isoleret fra en pool og individuelle fækalprøver fra Caserta. Der blev ikke påvist parasitter i muskelbiopsiprøverne eller i slimet.

Flere morfologiske typer af rhabditid nematoder blev isoleret fra sneglen afføring fast i 96% ethanol. Opnåede og redigerede sekvenser af dens og 18S af disse nematoder blev sammenlignet (BLAST) med materialet i GenBank og identificeret som R. A .ei (delvis 18S, tiltrædelsesnummer MK124578, lighed 99%), Rh., terricola (delvis 18 ÅR og delvis ITS1, accessionsnummer MK156052, lighed 100%), S. entomophagus (delvis 18 ÅR og delvis ITS1, accessionsnummer MK156050, lighed 99%) og Cruznema sp. (delvis 18S og delvis ITS1, tiltrædelsesnummer MK156051, lighed 96-100%).

Diskussion

resultaterne af denne undersøgelse indikerer, at alle de undersøgte gigantiske afrikanske landsnegle lægger æg, larver og voksne rhabditid nematoder i fæces og kan derfor repræsentere en kilde til infektion for andre kæledyr og mennesker. For at undgå fejlidentifikation med Strongyloides sp.,, en nematodeart, der viser tæt lighed med rhabditider, der har en klar parasitisk relevanceoonotisk relevans (14, 15, 18), blev den oprindelige morfologiske diagnose af rhabditid nematoder bekræftet gennem molekylære analyser.

Rhabditidae inkluderer fritlevende saprofytiske nematoder, der findes bredt i jord og organisk affald, hvor de hovedsageligt lever af bakterier. Mange arter af snegle kan tjene som endelige endelige værter for rhabditid nematoder (14, 15). Imidlertid har en række Rhabditis-og Rhabditella-arter været forbundet med hvirveldyr inklusive mennesker (14, 15, 19-27)., Selvom deres tilstedeværelse kan være resultatet af miljøforurening, kan disse nematoder forårsage sygdomme hos mange dyr og mennesker. Rhabditis elongata, Rh. hominis og Rh. usuii larver er blevet isoleret fra humane afføring, urin og vaginale podninger (19-21). Ikke desto mindre er der ikke rapporteret om mange tilfælde af symptomatiske infektioner hos mennesker (21-24). Feng og Li (25) beskrev to humane tilfælde af urininfektion af R. A .ei i Kina og Ahn et al. (20) rapporterede fem humane tilfælde af intestinal infektion med Rhabditis sp. i landdistrikterne skolebørn i Sydkorea., På samme måde, to tilfælde af menneskelige tarm-infektion, ved R. axei blev beskrevet i Kina (26), der henviser til, at en anden publicerede arbejde (21) rapporteret et tilfælde af mave-tarm-infektion i en 5-måneders-Brasiliansk barn, der blev præsenteret med feber og våde og blodig diarré; coprological undersøgelse viste, æg, larver og voksne i Rhabditis sp. Meamar et al. (27) beskrev forekomsten af vandig diarr.hos to iranske patienter med AIDS, der er forbundet med alvorlig tarminfektion med larver og voksne prøver af R. A .ei. Endelig Teschner et al., (24) beskrev for nylig et tilfælde af infektion i den ydre øregang hos en 37-årig mand præsenteret med purulent otorrhea fra begge ører og akut høretab forårsaget af Rhabditis sp. Generelt, Rhabditis spp. betragtes som en fælles årsag til ekstern otitis i kvæg, der lever i tropiske områder (fx, Sydamerika og Afrika), især hos ældre dyr, og er blevet identificeret også i høns, hunde og svin med incoercible diarré (18, 28-30). Imidlertid er asymptomatiske infektioner også blevet beskrevet, og disse nematoder betragtes ofte som pseudoparasitter (28, 29).,

selvom fritlevende nematoder blev hentet i alle fækale prøver, blev der ikke fundet nogen prøver i slim og histologiske prøver. En mulig forklaring på denne konstatering er, at nematoder kan lokalisere i forskellige væv/organer i deres værter, afhængigt af typen af forening nematode / mollusk vært (15, 31, 32). Rhabditis spp. Gennemfør sin livscyklus inde i sneglen, uden skade på dens bløddyr vært. Tidligere undersøgelser af de fritgående afrikanske snegle (Archachatina spp . og Achatina spp.) afslørede at R., a .ei lever i mave-tarmkanalen i sin snegl vært, hvor hele nematode livscyklus er afsluttet (31-33).

selvom afrikanske gigantiske snegle er opført som værter for R. A .ei, var forekomsten af denne nematode kun rapporteret hos nogle få arter af gigantiske afrikanske snegle bortset fra A. fulica, nemlig Archachatina marginata æg, Ar. marginata saturalis, og Achatina achatina (31). På den anden side har P. entomophagus en verdensomspændende distribution og har hovedsageligt været forbundet med møkkebiller, der tilhører superfamilien Scarabaeoidea (34, 35), R., terricola er fundet i salamandere (14, 15) og Cru .nema spp. i cricket Gryllodes laplatae (Orthoptera) (36). I alle tilfælde sker overførsel af parasitten gennem sneglens kontakt med forurenet fugtig jord, der er rig på nedbrydning af organisk stof (31, 37). Selv om alle dyrene i de nuværende tilfælde blev holdt i terraria med en varmebehandlet organisk jord, spekulerer vi på, at infektion kan have fundet sted før køb af dyrene hos dyrebutikker eller avlsfaciliteter.,

afslutningsvis viser vores resultater, at kæledyrsgiganten afrikanske landsnegle kan tjene som reservoir af flere rhabditid nematoder. Denne sneglearter er blandt de mest almindelige, der holdes som kæledyr, og bor derfor ofte i nærheden af mennesker. Som følge heraf er forureningen af det indenlandske miljø gennem deres afføring mulig. Selvom parasitære nematoder ikke blev isoleret i denne undersøgelse, bør de gigantiske afrikanske landsnegle stadig betragtes som potentielle bærere af nematoder, der er i stand til at forårsage opportunistiske sygdomme hos mennesker., Derfor fremhæver vi betydningen af yderligere epidemiologisk forskning om forekomsten af fritlevende og parasitære nematoder i gastropodsnegle, der holdes i fangenskab, og understreger behovet for strenge kontrolforanstaltninger for at reducere risikoen for opportunistisk infektion med rhabditid nematoder hos kæledyrsnegleejere.

forfatter Bidrag

Dd ‘ O og MS udtænkt og planlagt analysen. MS og JN gennemførte analysen. CA hjalp med at forme forskningen og redigerede manuskriptet. Alle forfattere gav kritisk feedback og bidrog til det endelige manuskript.,

Erklæring om interessekonflikt

forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

PubMed Abstract | Google Scholar