gelelektroforese Definition
gelelektroforese er en procedure, der bruges til at adskille biologiske molekyler efter størrelse. Adskillelsen af disse molekyler opnås ved at placere dem i en gel med små porer og skabe et elektrisk felt over gelen. Molekylerne vil bevæge sig hurtigere eller langsommere baseret på deres størrelse og elektrisk ladning.,
gelelektroforese oversigt
processen med gelelektroforese fungerer, fordi negativt ladede molekyler bevæger sig væk fra den negative pol i den elektriske strøm, og mindre molekyler vil bevæge sig hurtigere end større molekyler. Således opnås en størrelsesseparation inden for puljen af molekyler, der løber gennem gelen. Gelen virker på samme måde som en sigte, der adskiller partikler efter størrelse. Elektroforesen arbejder for at bevæge partiklerne ved hjælp af deres iboende elektriske ladning gennem sigten.,
Når forskere forsøger at skelne mellem forskellige segmenter af DNA, er processen for eksempel enkel. Prøverne lægges i kanaler ved starten af gelen. Hvert DNA-molekyle har den samme ladning (-1), fordi DNA dannes af de samme 4 nukleotider og altid bærer en lidt negativ ladning uanset dens størrelse. Derfor vil hvert DNA-molekyle have den samme kraft, der trækker det gennem gelen.
størrelsen af hvert molekyle forhindrer imidlertid dets fremskridt gennem gelen., Store molekyler rammer dele af gelmatrixen og sænkes. Små DNA-molekyler kan glide mellem de forskellige komponenter i gelmatrixen og hurtigt komme hen til den anden side af gelen. Efter en vis tid kan de farvede DNA-molekyler ses aggregerende i forskellige områder af gelen, baseret på hvor langt de bevægede sig under gelelektroforese. Dette gør det muligt for forskere at identificere segmenterne og sammenligne DNA fra forskellige organismer.
hvad anvendes Gelelektroforeser til?,
formålet med gelelektroforese er at visualisere, identificere og skelne molekyler, der er blevet behandlet ved en tidligere metode, såsom PCR, en .ymatisk fordøjelse eller en eksperimentel tilstand. Ofte køres blandinger af nukleinsyrer eller proteiner, der opsamles fra et tidligere eksperiment/metode, gennem gelelektroforese for at bestemme identiteten eller skelne mellem molekyler.,
Gel Elektroforese Skridt
Den brede trappe, der er involveret i en fælles DNA-gel-elektroforese protokol:
Klargøring af prøver for at køre
DNA er isoleret og preprocessed (fx PCR, enzymatiske fordøjelse) og lavet i en opløsning med nogle grundlæggende blåt farvestof til at hjælpe med at visualisere bevægelse af prøven gennem gelen.
der fremstilles en agarose TAE gel-opløsning
TAE-buffer tilvejebringer en kilde til ioner til opsætning af det elektriske felt under elektroforese., Vægt-til-volumen-koncentrationen af agarose i TAE-buffer anvendes til fremstilling af opløsningen. For eksempel, hvis en 1% agarosegel er påkrævet, tilsættes 1 g agarose til 100 ml TAE. Den anvendte agaroseprocent bestemmes af, hvor stor eller lille DNA ‘ et forventes at være. Hvis man ser på at adskille en pulje af mindre DNA-bånd (<500bp), fremstilles en højere procentdel agarosegel (>1%). Den højere procentdel af agarose skaber en tættere sigte for at øge adskillelsen af små DNA-længdeforskelle., Agarose-Tae-opløsningen opvarmes for at opløse agarosen.
støbning af gelen
agarose Tae-opløsningen hældes i en støbebakke, der, når gelopløsningen er afkølet og størknet, skaber en gelplade med en række brønde øverst.
opsætning af elektroforesekammeret
den faste gel anbringes i et kammer fyldt med TAE-buffer. Gelen er placeret således, at kammerbrøndene er tættest på kammerets negative elektrode.,
indlæsning af gelen
gelkammerbrøndene er fyldt med DNA-prøverne, og normalt indlæses en DNA-stige også som reference for størrelser.
elektroforese
de negative og positive ledninger er forbundet til kammeret og til en strømforsyning, hvor spændingen er indstillet. Tænd for strømforsyningen indstiller det elektriske felt, og de negativt ladede DNA-prøver begynder at migrere gennem gelen og væk fra den negative elektrode mod den positive.,
standsning af elektroforese og visualisering af DNA
Når det blå farvestof i DNA-prøverne er migreret langt nok gennem gelen, slukkes strømforsyningen, og gelen fjernes og anbringes i en ethidiumbromidopløsning. Ethidiumbromid interkalerer mellem DNA og er synligt i UV-lys. Nogle gange tilsættes ethidiumbromid direkte til agarosegelopløsningen i trin 2. Ethidiumbromidfarvet gel udsættes derefter for UV-lys, og der tages et billede. DNA-bånd visualiseres ind fra hver bane svarende til en kammerbrønd., DNA-stigen, der blev indlæst, visualiseres også, og længden af DNA-båndene kan estimeres. Et eksempel er angivet i nedenstående figur.
Typer af Gel Elektroforese
Der er to typer af gel elektroforese: indfødte og denaturering. Native gel elektroforese forsøger normalt at holde RNA eller protein i sin oprindelige struktur, mens den kører gennem gelen., Denaturering af gelelektroforese forsøger at reducere RNA eller proteinet i dets mest lineære struktur før eller under gelelektroforese.
denatureringen af RNA eller protein opnås ved at tilsætte et reduktionsmiddel til prøven, gelen og / eller bufferen. Reduktionsmidlet adskiller bindinger i RNA-eller proteinmolekylet og reducerer derved dets sekundære struktur. Den sekundære struktur af et protein eller RNA vil på en ikke-lineær måde påvirke, hvor hurtigt det migrerer gennem en gel., En denatureret, lineær form af RNA eller protein vil imidlertid migrere proportionalt til dens lineære størrelse (basepar eller kilo Dalton). Denaturering af gelelektroforese er ofte mere nøjagtig til identifikation af størrelse, hvorimod naturlig gelelektroforese normalt bruges til at identificere større proteinkomplekser.
eksempler på gelelektroforese
- TAE agarosegelelektroforese bruges mest til DNA.
- TBE og Denatureringsside (polyacrylamidgelelektroforese) er almindelige for RNA-adskillelse.,
- SDS side er en denaturerende gelelektroforese, der almindeligvis anvendes til proteinidentifikation og adskillelse.