Kræft refererer til en kompleks og heterogen gruppe af sygdomme karakteriseret ved ukontrolleret og ukontrolleret spredning af celler, som ofte erhverve evnen til at invadere andre væv. Kræft er normalt stammer i somatiske celler, der, som en konsekvens af en række genetiske mutationer, unddrage sig de mekanismer, der regulerer væv homøostase, såsom celle-til-celle-kontakt-inhibering, differentiering signaler og celledød induktion., De mutationer, der er ansvarlige for tumortransformation, vedrører to hovedgruppe af gener, kendt som proto-onkogener (stimulatorer af cellecyklussen) og tumorsuppressorer (undertrykkere af cellecyklusprogression). Disse funktionelle ændringer kan forekomme som en konsekvens af enkelt nukleotidmutationer, men de kan også være forårsaget af større modifikationer i genetisk materiale, såsom indsættelser, deletioner, duplikationer eller translokationer af et kromosomfragment. Disse abnormiteter i kræftceller kan bruges som tumor biomarkører., Kvantificering af ændringer i genkopieringsnummer eller genomarrangementer er afgørende for vores forståelse af tumorbiologi, og dermed vigtigheden af genetiske test baseret på molekylær cytogenetikprofilering.
Figur 1: Mærkning DNA-probe for FISK analyse.
Hvad er fisk ?
fluorescens in situ hybridisering (fisk) er en cytogenetisk teknik, der anvendes til påvisning og lokalisering af nukleotidsekvenser (DNA eller RNA) i væv eller celler., Fisk kan bruges til at “kortlægge” det genetiske materiale i humane celler, der giver information om placering, længde og antal kopier af specifikke gener eller kromosomdele. Det kræver syntese af en fluorescerende mærket sonde, som er en nukleinsyresekvens bundet til et fluorescerende reportermolekyle, som derefter binder (hybridiserer) til en bestemt målsekvens. Fisk prober kan mærkes ved forskellige metoder (f nick nick Oversættelse, tilfældig priming), startende fra forskellige nukleinsyrer input, som genomisk DNA/RNA, bakterielle kunstige kromosomer (BACs), eller cosmids.,
det første trin i FISKEPROCESSEN er immobilisering af metafase-kromosomale spreads eller interfaseceller, der indeholder mål-DNA ‘ et på et glasglas. Dernæst denatureres både DNA-prøven og FISKESONDEN af varme. Når sonden er i kontakt med det målgenetiske materiale, vil det specifikt binde til dets komplementære sekvens på kromosomet. Hybrider dannet mellem proberne og deres sekvensmål kan derefter visualiseres ved hjælp af et fluorescerende mikroskop (Figur 1)., Generelt er der to typer af FISH-prober, der kan sondres: kromosom tælling prober (CEPs eller CENs) rettet mod pericentromeric områder af kromosomet, og bruges til at optælle kromosomer; og locus-specifikke indikatorer (LSI), der specifikt genkender gener af interesse.
Figur 2: Eksempel på FISK resultater: Nick Oversættelse DNA Mærkning System 2.0 blev brugt til at mærke BAC DNA-probe for TP53 med SEEBRIGHT® Orange 552 dUTP og BAC DNA-probe for Centromer 17 med SEEBRIGHT® Green 496 dUTP., Mærkede prober blev hybridiseret til metafasespreads. (Institut Universitaire du Kræft Toulouse Oncopole)
FISK har flere fordele i forhold til andre klassiske cytogenetiske teknikker, såsom G-banding karyotyping. For det første har den en højere opløsning (20-150kb vs 5Mb). Derudover kan fisk påføres både metafase-og interfasekromosomer, hvilket betyder, at celler ikke behøver at dyrkes i flere dage, før kromosomer kan forberedes til analyse., Dette indebærer også, at fisk er egnet til analyse af forskellige slags prøvetyper, herunder faste tumorer og formalinfikserede paraffinindstøbte (FFPE) væv. Desuden kan FISKESONDER mærkes med forskellige fluoroforer, hvilket giver mulighed for samtidig overvågning af flere steder.
FISKERI-Kromosom Aberrationer i Kræft
Takket være dens alsidighed, FISK kan anvendes til cytogenetiske analyser af både solide tumorer (fx brystkræft, ikke-småcellet lungekræft, tyk-og endetarmskræft) og hematological eller kræft i blodet (fx leukæmi, lymfomer, myelomatose)., Påvisning af genetiske abnormiteter er nyttig ikke kun for kræft, men også som et redskab til at analysere genetisk disponering og sygdomsspecifik information og til at forudsige et kemoterapeutisk resultat.
fisk til lungekræft
lungekræft er den mest diagnosticerede og den førende årsag til kræftrelaterede dødsfald. Især tegner ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) sig for ~80-85% af alle lungekræft. Somatiske mutationer på EGFR – og ALK-gener er ofte forbundet med NSCLC., EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) er en gruppe af tyrosin-kinase-receptorer, hvis aktivitet er blevet dereguleret i forskellige typer af maligne epiteliale (herunder lungekræft), da de spiller en vigtig rolle i cancer celle proliferation, angiogenese og metastase. Af denne grund udnyttes forskellige strategier til at forstyrre EGFR-funktionen ofte til patientterapi. Inhibitorer af tyrosinkinaseaktiviteten af disse receptorer (f.eks. erlotinib, gefitinib) anvendes i vid udstrækning i kliniske NSCLC-behandlinger., På grund af de forskellige genetiske mutationer, der ligger til grund for EGFR-dysfunktionen, er nogle patienter desværre ufølsomme over for denne type behandling. Forskellige grupper af patienter kan faktisk skelnes ud fra den type ændring, der bæres af EGFR, såsom genforstærkning, deletion eller enkelt nukleotidsubstitutioner, som kan ændre dens aktivitet på forskellige måder (dvs.ikke via tyrosinkinasedomænet). Som et resultat er EGFR-kopinummeret bestemt af fisk en af de biomarkører, der bruges til at vælge den rigtige terapi.,
Fisk bruges ofte til at detektere inversioner eller translokationer i ALK-genet. ALK-genet er placeret på den korte arm af kromosom 2 (2p23) og koder for den transmembrane tyrosinkinaseceptor. ALK bør ikke udtrykkes i den voksne lunge. Under patologiske forhold bryder ALK-genet imidlertid og smelter dets 3 ‘(indeholdende tyrosinkinasedomænet) sammen med 5’ af andre gener. Denne begivenhed kan føre til ukontrolleret aktivering af alk nedstrøms signalveje. Den mest almindelige fusion forekommer med EML4 på grund af en inversion på den korte arm af kromosom 2.,
Fisk er den FDA-godkendte metode til at detektere inversioner eller translokationer i ALK-genet. Typisk mærkes prober, der er rettet mod genets 3′ og 5′ – region, med forskellige fluoroforer: i negative kerner vises farverne tæt på hinanden (ofte overlappende), mens signalerne i kræftceller opdeles fra hinanden som et resultat af kromosomomlejringen (figur 4).
Figur 3: Repræsentant opfattelse af ALK-genet translokation opdaget af FISK., 5′ og 3 ‘ regioner af genet visualiseres med henholdsvis en grøn og en rød fluorescens. A. kerne af vild type. B. Kræftcellekerne, der viser de karakteristiske prober opdelt. C. Kræftcellekerne, der viser de karakteristiske prober opdelt. En tredje sonde kan bruges til at definere den kromosomomlejring, der faktisk forekommer.
En tredje sonde, der er målrettet mod den potentielle ALK-partner, kunne yderligere bekræfte og definere den kromosomomlejring, der forekommer hos en patient (figur 4C)., Lungekræft, der indeholder mutationer, der fører til hyperaktivering af ALK, kan behandles med ALK-hæmmere, såsom Cri .otinib.
fisk til brystkræft
dette er den mest almindelige malignitet hos kvinder og den næstledende årsag til kræftrelateret død på verdensplan. Brystkræft er ofte kendetegnet ved abnormiteter i receptorstatus, hvilket fører til en opregulering af cellulære transduktionsveje, der er ansvarlige for celleproliferation og overlevelse. 20-30% af brystkræfttumorer for at overudtrykke HER2/Neu, et medlem af EGFR-familien., En almindelig behandling i disse tilfælde er Trastu .umab, et humaniseret monoklonalt antistof godkendt af FDA i 1998 til behandling af brystkræft. Dens nøjagtige molekylære mekanisme skal stadig belyses, men dette antistof forhindrer sandsynligvis HER2-aktivering ved at binde til dets ekstracellulære domæne. Derudover ser det ud til at inducere tumorcellelyse, der stimulerer den antistofafhængige cellulære cytotoksicitet (ADCC). Fisk, der bruger en passende sonde mod HER2, kan bruges til at identificere ekstra kopier af genet, et tegn på, at det mere sandsynligt reagerer på Trastu .umab-behandling.,
Figur 4: Repræsentant betragtning af den potentielle breast carcinoma celler. HER2 signal er repræsenteret i rødt; centromere 17 sonde (grøn) kan bruges til at opregne kromosom nummer. A. HER2-ikke-forstærket brystkarcinom: to centromerer 17 og to kopier af HER2-genet som forventet. B. HER2-amplified breast carcinoma multiple detection for HER2.
FISK for blærekræft
Det er den femte mest almindelige menneskers malignitet, og den anden oftest diagnosticeret genitourinary tumor efter prostatakræft., Det er en polygenisk sygdom, hvilket betyder, at den har været forbundet med flere genetiske anomalier, såsom mutationer i FGFR3 -, RB1 -, HRAS -, TP53-eller TSC1-gener. Imidlertid er initieringsbegivenheden sandsynligvis en mutation i 9p21-regionen, der indeholder P16/CDKN2A-genet. Derudover er blærecancerceller karakteriseret ved en forhøjet grad af kromosomstabilitet (CIN). Dysfunktionel kromosomduplikation eller adskillelse under mitose forårsager DNA-omlejringer og translokationer, gevinst eller tab af hele kromosomer (aneuploidi) eller kromosomfragmenter., Den resulterende ubalance af det genetiske materiale forværres efter hver cellecyklus. De deraf følgende genomiske mønstre kan relateres til de forskellige stadier af tumorudvikling, hvor de mere invasive former viser det højere antal cytogenetiske ændringer.
de numeriske og strukturelle kromosomale ændringer, der findes i blærecancerceller, kan bruges som tumormarkører.
specifikt er samtidig påvisning af kopi nummervariation af kromosomer 3, 7 og 17 og sletning af 9p21-regionen (indeholdende p16) af fisk ved hjælp af fire forskellige prober en almindelig praksis., Denne metode er nyttig til at give information om kræftprogression og gentagelse.
FISK for Kronisk Lymfatisk Leukæmi (CLL)
Analyser af hematological maligniteter er et af de typiske eksempler på fordele af FISK til analyse af prøver er karakteriseret ved en variabel karyotype og en lav mitotiske aktivitet. CLL er den mest almindelige leukæmi hos voksne. Det har ikke været forbundet med en specifik tilbagevendende genetisk ændring., I stedet ligner blærekræft et panel af forskellige mutationer er blevet forbundet med forskellige sværhedsgrader af sygdommen og anvendes som prædiktive indikatorer for patientens kliniske forløb. FISKEPANELER inkluderer i dette tilfælde ofte prober til påvisning af trisomi 12 og sletninger 11., 13. og 17p., Sletning 11q, som i de fleste tilfælde vedrører genet HÆVEAUTOMAT, er fundet i patienter, der viser, at en hurtig progression af kræft; trisomi 12 er forbundet med fremskredne stadier af sygdommen, resistens over for kemoterapi og kortere overlevelse gange; sletning 13q er den mest almindeligt forekommende og er generelt forbundet med en mere gunstig prognose, sletning 17p ofte omfatter en sletning af TP53 genet, og svarer til avanceret stadium af tumor med en dårlig overlevelse sats.
En .o Life Sciences er en global leder inden for DNA-og RNA-mærkningsteknologier., Vi tilbyder en række produkter til dine Genomics og kræftforskning behov. For en enkel og effektiv metode til at generere mærket DNA, kan du tjekke vores Nick oversættelse DNA mærkning kit samt en liste over vores SEEBRIGHT® fluorescerende farvestof-dUTPs og vores Allylamin-dUTP. Usikker på, om du skal bruge biotin eller digo ?igenin til ISH probe mærkning? Vi kan hjælpe dig der! Glem ikke at tjekke en .o ‘ s spectra vie .er for e .citations-og emissionsbølgelængdeprofiler af almindelige farvestoffer og vores andre fluorescenscellebaserede assays., Mens du er ved det, kan du tjekke vores TechNote om fordele og ulemper af FISK, aCGH, og NGS, og Hvordan du bruger allylamin-dUTP for FISKE-DNA probe-mærkning. For alle spørgsmål og bekymringer vedrørende nogen af vores produkter, vores tekniske Support Team er her for at hjælpe.