Et udkast til genom af Yersinia pestis fra ofre for den Sorte Død | Nature

Den Sorte Død 1347-1351, forårsaget af bakterien Yersinia pestis2,3, giver en af de bedste historiske eksempler på en ny infektion med hurtig spredning og høj dødelighed, hævder en skønsmæssigt 30-50% af den Europæiske befolkning på kun fem år period4. Uoverensstemmelser i epidemiologiske tendenser mellem den middelalderlige sygdom og moderne Y. pestis-infektioner har antændt kontrovers over pandemiens ætiologiske agent5,6., Selv om ancient DNA-undersøgelser har stærkt impliceret Y. pestis2,3 i den gamle pandemi, genetiske ændringer i bakterien kan være delvist ansvarlig for forskelle i sygdom manifestation og sværhedsgrad. For at forstå organismens udvikling det er nødvendigt at karakterisere de genetiske ændringer, der er involveret i omstillingen fra en sylvatisk patogenet til en stand af pandemisk menneskelig infektion på omfanget af den Sorte Død, og til at bestemme dens forhold til i øjeblikket cirkulerer stammer., Her begynder vi denne diskussion ved at præsentere det første udkast til genomsekvens af det gamle patogen.

Y. pestis er en nylig udviklet sig efterkommer af de jordboende bacillus Yersinia pseudotuberculosis7, som i løbet af dets udvikling, der er erhvervet yderligere to plasmider (pMT1 og pPCP1) at give det specialiserede mekanismer for at infiltrere pattedyr værter. For at undersøge potentielle evolutionære ændringer i et af disse plasmider rapporterede vi om screeningen af 46 tænder og 53 knogler fra East Smithfield collection of London, England for tilstedeværelse af Y., pestis-specifik pPCP1 (ref . 3). Historiske data viser, at Øst Smithfield gravplads blev etableret i slutningen 1348 eller begyndelsen af 1349 specielt til begravelsen af Sorte Død victims8 (Supplerende Figner 1 og 2), hvilket gør samlingen velegnet til genetiske undersøgelser af gamle Y. pestis. DNA-sekvens data for fem tænder opnået via molekylære fange af den fulde Y. pestis-specifikke pPCP1 afslørede en C-T skader mønster, der er karakteristisk for autentisk endogene gamle DNA9, og samling af de samlede Illumina læser tilladt genopbygningen af 98.68% af det 9.,6-kilobase plasmid med mindst dobbelt dækning3.

for At vurdere egnetheden af capture-baserede metoder til at rekonstruere den komplette gamle genom, flere DNA-ekstrakter fra både rødder og rodstokke, der stammer fra fire af de fem tænder, der gav den højeste pPCP1 coverage3 blev brugt til array-baseret berigelse (Agilent) og efterfølgende high-throughput-sekventering på Illumina GAII platform10. Fjernelse af dobbeltmolekyler og efterfølgende filtrering frembragte i alt 2.366.647 kromosomaflæsninger af høj kvalitet (supplerende tabel 1a, b) med en gennemsnitlig fragmentlængde på 55.,53 basepar (supplerende fig. 4), hvilket er typisk for det gamle DNA. Dækning skøn gav et gennemsnit på 28.2 læser per stedet for kromosom, og 35.2 og 31.2 for pCD1 og pMT1 plasmider, henholdsvis (Fig. 1a, c, d og supplerende tabel 1b, c). Dækningen var forudsigeligt lav for pPCP1(Fig . 1e), fordi prober, der er specifikke for dette plasmid, ikke var inkluderet i arrayerne. Dækning korreleret med GC-indhold (supplerende fig. 6), en tendens tidligere observeret for high-throughput sekvens data11., Dækningen på hver halvdel af kromosomet var ujævn på grund af forskelle i sekventeringsdybde mellem de to arrays, med 36.46 og 22.41 gennemsnit læser pr. Selv om større dybde bidrog til mere gennemsnitlige aflæsninger pr. lokalitet, øgede den ikke den samlede dækning, idet begge arrays dækkede 93,48% af de målrettede regioner med et minimum af en gang dækning (supplerende tabel 1b)., Dette indikerer, at vores fange procedure med succes hentet skabelon molekyler fra alle genomiske regioner, der er tilgængelige via denne metode, og at den dybere sekventering ikke ville resultere i yderligere data for CO92 skabelon regioner, der ikke er omfattet af vores datasæt.

Figur 1: dækning plots for genomiske regioner sekventeret.

Genom arkitektur er kendt for at variere meget blandt de bevarede Y. pestis strains12. At ekstrapolere gen orden i vores gamle genom, vi analyserede læser kortlægning til CO92 reference for alle ekstrakter stammer fra et enkelt individ, der gav den højeste dækning (individuel 8291). På trods af den korte læselængde af vores gamle sekvenser og den meget gentagne karakter af Y. pestis genomet blev 2,221 contigs matchende CO92 ekstraheret, omfattende i alt 4,367,867 bp., At identificere potentielle regioner i det gamle genom, der er arkitektonisk adskilt fra CO92, alle læser ikke kortlægning til co92 reference blev igen overvejet til contig konstruktion. Efter filtrering for en minimumslængde på 500 bp forblev 2,134 contigs bestående af 4,013,009 bp, hvoraf 30,959 stammede fra ikke-kortlagte læsninger. Konventionel BLAST søgning forespurgt mod CO92 genom identificeret kampe for 2,105 contigs. Bevis for ændret arkitektur blev identificeret i 10 contigs (supplerende tabel 2). Et eksempel på en sådan strukturel variant er vist i Fig., 2, Hvor reference-guidet samling inkorporerer unmapped læser at spænde breakpoint validerer sin genopbygning. Denne specifikke genetiske orientering er kun findes i Y. pseudotuberculosis og Y. pestis stammer Mictrotus 91001, Angola, Pestoides F og B42003004, som er forfædre til alle Y. pestis, der almindeligvis er forbundet med humane infektioner (gren 1 og afdeling 2 strains13,14). Desuden indikerer uoverensstemmelser i arrangementet af denne region i gren 1 og gren 2 moderne Y. pestis-stammer, at omarrangementer forekom som separate begivenheder på forskellige linjer.,

Figur 2: Tilpasning af den tilknyttede rekonstrueret contigs mod CO92 og Microtus genomer.

Single-nucleotide forskelle mellem vores gamle genom og CO92 reference overraskende kun bestod af 97 kromosomale holdninger, og 2 og 4 positioner i pCD1 og pMT1 plasmider, henholdsvis (Supplerende Tabel 3), hvilket indikerer, stramme genetiske bevarelse i denne organisme i løbet af de sidste 660 år. Syvogtyve af disse positioner blev ikke rapporteret i en tidligere analyse af eksisterende Y., pestis diversitet14 (supplerende tabel 3 og 4). Sammenligning af vores gamle genom med dets forfader Y. pseudotuberculosis afslørede, at den middelalderlige sekvens indeholdt det forfædres nukleotid for alle 97 positioner, hvilket indikerer, at det ikke har nogen afledte positioner fraværende i andre Y. pestis-stammer. To tidligere rapporteret kromosomale differences3 ikke var til stede i vores genomisk sekvens data, hvilket tyder på, at de formentlig hidrører fra deamineret cytosines, der ville have været fjernet i den aktuelle undersøgelse, via uracil-DNA glycosylase for behandling, før array fange.,

for At placere vores gamle genom i et fylogenetisk sammenhæng, vi har karakteriseret alle 1,694 tidligere identificerede fylogenetisk informative positions14 (Supplerende Tabel 4), og sammenlignet dem fra vores gamle organismen mod den samlede base ring data for 17 offentligt tilgængelige Y. pestis genomer og slægts-Y. pseudotuberculosis. Når de betragtes separat, sekvenser fra tre af de fire ofre falder kun to substitutioner fra roden af alle eksisterende humane patogene Y. pestis stammer (fig. 3a), og de viser et tættere forhold til gren 1 Y., pestis end til gren 2; imidlertid blev et af de fire ofre (individuel 6330) inficeret med en stamme, der indeholdt tre yderligere afledte positioner set i alle andre gren 1 genomes14. Dette antyder enten tilstedeværelsen af flere stammer i London 1348-1350-pandemien eller mikroevolutionære ændringer, der opstår i en stamme, hvilket vides at forekomme i sygdomsudbrud15. Yderligere støtte til Y., pestis mikroevolution er indikeret ved tilstedeværelsen af flere variantpositioner, for hvilke sekvensdata fra et individ viser to forskellige nukleotider ved sammenlignelige frekvenser (supplerende tabel 5). Position 2896636 er for eksempel en kendt polymorf position i eksisterende Y. pestis-befolkninger14, og denne position viser den faste afledte tilstand i et individ (6330) og den polymorfe tilstand i en anden (individuel 8291) ved mindst femdoblet dækning (supplerende fig. 7). Dette giver et bemærkelsesværdigt eksempel på mikroevolution fanget under en historisk pandemi., De resterende varianspositioner er uændrede i de 18 eksisterende Yersinia-genomer, således kan de være unikke for den gamle organisme og er derfor af yderligere interesse. Yderligere prøvetagning af gamle genomer vil hjælpe med at bestemme hyppigheden af disse mutationer i co-cirkulerende Y. pestis stammer, og vil belyse fremkomsten af filial 2 stammer, der er endnu urapporteret i gamle prøver.

figur 3: fylogenetisk placering og historisk kontekst for East Smithfield-stammen.,

i Overensstemmelse træ topologier blev produceret ved hjælp af flere byggemetoder og alle vigtige knudepunkter, som blev støttet af posterior sandsynligheden (pp) værdier af >0.96, og bootstrap-værdier >90 (Fig. 3b og supplerende Fig 8 og 9). Træerne placerer East Smithfield-sekvensen tæt på forfædrenes knudepunkt for alle eksisterende humane patogene Y. pestis-stammer (kun to forskelle i 1.694 positioner) og ved bunden af gren 1 (fig. 3b)., En sikker Dato for East Smithfield-stedet i 1348-1350 gjorde det muligt for os at tildele en tipkalibrering til den gamle sekvens og således datere divergenstiden for de moderne genomer og East Smithfield-genomet ved hjælp af en bayesisk tilgang. Tidsmæssige skøn viser at alle Y., pestis, der almindeligvis er forbundet med menneskelige infektion delte en fælles forfader engang i mellem 668 729 år siden (ad 1282-1343, 95% højeste sandsynlighed tæthed, HPD), som omfatter en meget mindre tidsinterval end nylig offentliggjort estimates14 og yderligere angiver, at alle i øjeblikket cirkulerer gren 1 og afdeling 2-isolater, der opstod i løbet af det trettende århundrede i de tidligste (Fig. 3b), der potentielt stammer fra en østasiatisk kilde, som det tidligere er blevet antydet14., Dette indebærer, at den middelalderlige pest var den vigtigste historiske begivenhed, der introducerede menneskelige befolkninger til forfader for alle kendte patogene stammer af Y. pestis. Denne yderligere spørgsmål ætiologi af den sjette til ottende århundrede Pest af Justinian, populært antages at have medført den samme patogen: vores timelige skøn indebærer, at pandemien var enten forårsaget af en Y. pestis variant, der adskiller sig fra alle i øjeblikket cirkulerer stammer ofte forbundet med infektioner, eller var det en anden sygdom helt.

selvom vores tilgang til at bruge en eksisterende Y., pestis reference skabelon for agn design udelukket vores evne til at identificere genomiske regioner, der kan have været til stede i de gamle organisme, og efterfølgende blev tabt i CO92, genomisk sammenligninger af vores gamle sekvens mod sin nærmeste outgroups kan give et værdifuldt indblik i Y. pestis evolution. Microtus 91001-stammen er den nærmeste gren 1 og gren 2-relativ bekræftet at være ikke-patogen for mennesker16, hvorfor genetiske ændringer kan repræsentere Bidrag til patogenens tilpasning til en menneskelig vært., Sammenligninger med denne outgroup afsløret 113 ændringer (Supplerende Tabel 6a, b), hvoraf mange er fundet i gener, der påvirker virulens-tilhørende funktioner som biofilmdannelse (hmsT), jern-køb (iucD) eller tilpasning til den intracellulære miljø (phoP). På samme måde, selv om dets virulenspotentiale hos mennesker endnu ikke er bekræftet til vores viden, er Y. pestis B42003004 isoleret fra en kinesisk marmotbefolkning17 blevet identificeret som den stamme, der er tættest på forfædrenes knudepunkt for alle Y., pestis ofte forbundet med menneskelig pest, og dermed kan give vigtige oplysninger om organismens udvikling. Fuld genomsammenligning mod East Smithfield-sekvensen afslørede kun otte enkelt-nukleotidforskelle (supplerende tabel 6c), hvoraf seks resulterer i ikke-synonyme ændringer (supplerende tabel 6d). Selvom disse forskelle sandsynligvis ikke påvirker virulens, er påvirkningen af gentab, gengevinst eller genetiske omlejringer,som alle er veldokumenteret i Y. pestis12, 18, endnu ikke fastlagt., I nyere evolutionære vilkår, single-nucleotide forskelle i flere kendte sygdomsfremkaldende-associerede gener, der blev fundet mellem vores gamle genom og CO92 reference sekvens (Supplerende Tabel 3), hvilket kan udgøre en yderligere tilpasninger til menneskelige værter.,

gennem berigelse ved DNA-indfangning kombineret med målrettet DNA-sekventering med høj gennemstrømning har vi rekonstrueret et udkast til genom for det, der uden tvivl er det mest ødelæggende menneskelige patogen i historien, og afsløret, at den middelalderlige pest i det fjortende århundrede sandsynligvis var ansvarlig for dens introduktion og udbredt distribution i menneskelige populationer. Dette indikerer, at patogenet involveret i Den Sorte Død har nære slægtninge i det enogtyvende århundrede, der både er endemiske og spirende19., Introduktioner af nye patogener til befolkninger er ofte forbundet med øget forekomst og sværhedsgrad af disease20 og selv om de mekanismer, der regulerer dette fænomen er complex21, genetiske data fra det gamle smitsomme sygdomme vil yde et uvurderligt bidrag til vores forståelse af vært–patogen coevolution. Den Sorte Død er et banebrydende eksempel på en ny infektion, der rejser i hele Europa, og kostede i en anslået 30 millioner mennesker i kun 5 år, hvilket er meget hurtigere end nutidens priser af bubonic eller pneumonic pest infection22 og dissemination7,8., Uanset, selv om der ikke eksisterede Y. pestis stamme besidder den samme genetiske profil, som vores gamle organisme, vores data tyder på, at par ændringer i kendte virulens-gener, der er forbundet har optjent i organismens 660 års evolution som et menneskeligt patogen, yderligere tyder på, at dens opfattes øget virulens i history23 kan ikke være på grund af nye faste punkt mutationer påvises via den analytiske tilgang, der er beskrevet her., På vores aktuelle beslutning, vi postulere, at molekylære ændringer i patogener, men en del af en konstellation af faktorer, der bidrager til at ændre smitsom sygdom forekomst og sværhedsgrad, hvor genetik af værten population24, climate25, vektor dynamics26, sociale conditions27 og synergistisk interaktion med samtidige diseases28 bør være forrest i diskussioner af befolkningen modtagelighed for smitsomme sygdomme og vært–patogen relationer med reference til Y. pestis infektioner.

Skriv et svar Annuller svar